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丙型肝炎病毒核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒

时间：2021-05-20 10:45:25

【生产厂家】深圳市达尔安生物工程有限公司

【批准文号】国药准字S0091

【剂型】检测试剂盒

【规格】10人份

【医保类型】

【国家基本药物】否

【英文名】Hepatitis C virus fluorescence polymerase chain reaction (PCR) diagnostic kit

【汉语拼音】bing xing gan yan (HCV) he suan kuo zeng (PCR) ying guang jian ce shi ji he

【原理和用途简介】

本试剂盒采用一对丙肝病毒特异性引物和一条丙肝病毒特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTPs)等成分，用PCR体外扩增法，通过荧光信号的变化，经过逆转录检测丙肝病毒RNA。本品适用于临床血清标本中HCV RNA的定性检测，可用于丙型肝炎的辅助诊断。

【试剂盒组成】

10人份/包装

组份/规格数量用途

RNA提取液A(100ul/管) 1管样本处理

RNA提取液B(1000ul/管)2管样本处理

HCV反应液I (180μl/管)1管逆转录

逆转录酶系(20μl/管) 1管逆转录

HCV反应液II(460μl/管)2管核酸扩增

Taq酶(3μl/管) 20管核酸扩增

DEPC H2O(1000μl/管) 2管样本处理

阴性质控品(200μl/管)1管核酸扩增

临界阳性质控品(200μl/管) 1管核酸扩增

强阳性质控品(200μl/管) 1管核酸扩增

【操作步骤】

1.标本采集、保存、运送和保存用无菌注射器抽取受检者静脉血1毫升，注入无菌1.5ml Eppendoff管，于室温静置2小时，转入4℃静置1小时。8,000rpm离心5分钟，吸取200μl血清(注意勿带入红细胞)转入另一无菌1.5ml Eppendoff管，即为血清标本。

标本可立即用于测试(48小时以内)，也可保存于-20℃待测(冻存前加20uRNasin)，保存期为6个月。标本运送应采用0℃冰壶。

2.适用仪器

PCR仪应尽可能采用孔间均一性良好的仪器，如PE9600等，以提高准确度。不宜采用直接接触式水浴PCR仪，以免管壁外沾染石蜡油，影响荧光测定。

采用上海棱光技术有限公司生产的DA620型微量荧光检测仪。

3.标本和质控品的处理

向一新的经高压灭菌处理过的0.5ml离心管中加入10μl充分混匀的RNA提取液A

(RNA提取液A易沉淀，取样前需用移液器反复吸打混匀后吸取)。加入50μl血清标本或阴阳性质控品，再加入200μl的RNA提取液B充分混匀。室温放置5分钟，6000rpm，离心1分钟，小心吸去上清，用75%的预冷乙醇(DEPC水配制)洗沉淀两次。(取75%乙醇450μl洗沉淀，充分震荡混匀，6000rpm，离心1分钟，然后去上清，再用75%的乙醇450μl洗一次)，65℃干燥沉淀10分钟。(注:75%乙醇配制时须用试剂盒中提供的DEPC H2O)。

4.逆转录

向沉淀管加入9μl HCV反应液I以及逆转录酶系1μl，震荡混匀，瞬时(3秒)离心后37℃放置45分钟，95℃加热3分钟。瞬时(3秒)离心后，吸取5μl逆转录产物上荧光定量。

5.PCR反应前荧光检测

取PCR反应管一管，直接加入处理后样品或定量标准品5μl，6000rpm离心数秒。将各反应管放入PCR仪，按下列条件扩增:

93℃→2分钟预变性,然后按93℃ 45秒→55℃ 120秒,反应10个循环后置33℃保温，3分钟后迅速逐个将反应管放入荧光检测仪，读取并记录读数A0。荧光激发波长为487nm,检测波长为525nm。最后按93℃ 45秒→55℃ 120秒,共做30个循环后置33℃保温。

6.PCR反应后荧光检测

待各PCR管充分冷却至33℃后，3分钟后迅速逐个将扩增后的反应管放入荧光检测仪，读取并记录读数A1。荧光激发波长为487nm,检测波长为525nm。

【结果判定】

1.计算:Ax=A1-A0

2.实验有效性判别

将阴性对照管的Ax称为N，临界阳性标准品的Ax值称为P1，强阳性标准品的Ax称为P2,若此3值满足P2>P1>N,则本次实验有效。否则，实验无效，应检查试剂、仪器、反应条件等方面的误差。

3.结果判定