本发明属于高分子生物材料技术领域，具体涉及一种具有最高临界溶液温度和聚集诱导发光荧光性质的聚合物及制备与应用。
背景技术：
响应型聚合物材料在生物材料领域一直都是引人注目的方向之一，这类材料通过环境变化的刺激而发生自身的物理或化学性质的改变。这些刺激包括ph、温度、光、离子等。温度响应型聚合物材料的研究最为广泛，这类材料会随着温度的变化而发生亲-疏水之间的相转变，主要分为具有最低临界溶液温度(lcst)和最高临界溶液温度(ucst)两大类。根据其特性，温敏聚合物已被广泛应用于传感器、组织培养、药物输送等领域。而在药物载体研究方面，研究最多的还是lcst类型的聚合物。这类聚合物载体是在温度达到相变温度之后，聚合物链会脱水收缩而引起药物释放，但是这种机制一般不能使药物完全释放。而相反，ucst类型聚合物在相变温度以上聚合物链会发生解离，因此作为药物载体可以促进药物的完全释放，因此ucst聚合物是要比lcst聚合物更适合应用于载药。但是目前ucst类型聚合物药物载体相关研究还比较少，且多是基于聚(丙烯酰胺-丙烯腈)这个体系。因此开发更合适的ucst聚合物载药体系不但具有重要的基础研究意义，更具有重大的应用价值。
荧光成像是在现代医学中广泛使用的影像技术，荧光技术的发展，对推动诊疗一体化的进步有着重要的贡献。具有聚集诱导发光(aggregation-inducedemission，aie)特性的荧光材料在2001年被发现，到如今，这类材料已成为荧光成像研究领域中不可缺少的大家族。区别于传统荧光分子聚集引起猝灭的缺点，基于aie的分子在聚集态下会发出更强的荧光，同时还具有免漂洗等优点，因而在医学成像领域具有强大的应用潜力。
若将aie荧光成像和温敏型药物载体特别是ucst类型聚合物载体结合，让载体携带aie荧光分子，使其本身能稳定的发射荧光，通过荧光成像技术等就能观察到载体在不同温度下的响应情况，也能观测到载体运输途径、药物释放程度、释放位置、预测治疗反应等信息，大大丰富载体的功能性和实用性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有最高临界溶液温度(ucst)和聚集诱导发光(aie)荧光性质的聚合物及其制备方法。本发明的聚合物由胆酸衍生丙烯酰胺caa单体、四苯基乙烯衍生丙烯酰胺tpea单体、丙烯酰胺(aam)单体在引发剂和链转移试剂的作用下共聚而成。caa单体是由氨基改性胆酸甲酯和4-硝基苯基丙烯酸酯(npa)反应而成；tpea单体是由四苯乙烯(tpe)衍生物和丙烯酰氯反应而成。caa和aam的结合赋予聚合物ucst的温度响应性，其ucst随浓度的增大而升高，tpea给予聚合物聚集诱导发光荧光功能。
本发明的另一目的在于提供上述具有最高临界溶液温度和聚集诱导发光荧光性质的聚合物的应用。所述聚合物用作药物载体。所述药物载体在药物递送方面的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种具有最高临界溶液温度和聚集诱导发光荧光性质的聚合物的制备方法，包括以下步骤：以有机溶剂为反应介质，在反应介质中，胆酸衍生丙烯酰胺(caa)、四苯基乙烯衍生丙烯酰胺(tpea)和丙烯酰胺(aam)在引发剂和链转移试剂的作用下共聚反应，后续处理，得到聚合物(patc)。
所述胆酸衍生丙烯酰胺(caa)的结构式为：
所述四苯基乙烯衍生丙烯酰胺(tpea)的结构式为
所述反应的温度为60～70℃，反应的时间为22～24h；所述反应在保护性气体的氛围中进行。
所述胆酸衍生丙烯酰胺(caa)的用量为聚合物单体摩尔量的2％-5％，四苯基乙烯衍生丙烯酰胺(tpea)的用量为聚合物单体摩尔量的0.2％-1％；聚合物单体为胆酸衍生丙烯酰胺(caa)、四苯基乙烯衍生丙烯酰胺(tpea)和丙烯酰胺(aam)。
所述链转移剂为cmdt(氰基甲基十二烷基三硫代碳酸酯)、cppa(4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸)、cdpa(4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸)中一种以上。
所述引发剂为aibn(偶氮二异丁腈)。
所述聚合物单体(胆酸衍生丙烯酰胺、四苯基乙烯衍生丙烯酰胺和丙烯酰胺)∶链转移剂∶引发剂的摩尔比为(300～500)∶1∶(0.1～0.3)。
所述有机溶剂为dmso。聚合物单体在有机溶剂中的浓度为200-300mg/ml。
所述后续处理是指反应完成后，将反应体系置于冰水中降温，再加入dmso稀释，然后滴加到沉淀剂(如甲醇)中，离心，真空干燥。
所述caa单体通过以下方法得到：
以有机溶剂为反应介质，氨基改性胆酸甲酯与4-硝基苯基丙烯酸酯(npa)在缚酸剂的作用下反应，后续处理，获得caa单体。所述缚酸剂为三乙胺、吡啶、n，n-二异丙基乙胺或三乙醇胺中一种以上。
所述有机溶剂为甲醇。所述反应的条件为室温搅拌24-36h。
所述氨基改性胆酸甲酯结构为：
所述氨基改性胆酸甲酯、npa和缚酸剂的摩尔比为1∶(1.5～2)∶(2～3)，氨基改性胆酸甲酯在有机溶剂中浓度为200-250mg/ml。
所述后续处理是指通过硅胶柱色谱法后经旋转蒸发。所述硅胶柱色谱法纯化方式是：先用乙酸乙酯∶甲醇＝20∶1(v/v)除去副产物，再用乙酸乙酯：甲醇＝10∶1(v/v)洗脱。
所述tpea单体通过以下方法制备得到：以有机溶剂为反应介质，tpe衍生物与丙烯酰氯在缚酸剂的作用下反应，后续处理，获得tpea单体。所述缚酸剂为三乙胺、吡啶、n，n-二异丙基乙胺或三乙醇胺中一种以上。
所述tpe衍生物结构为：
所述tpe衍生物与丙烯酰氯的质量比为(200～300)∶(90～135)。所述tpe衍生物和缚酸剂的质量比为(200～300)∶(75～110)。所述tpe衍生物与有机溶剂中用量比(200～300)mg∶(8～12)ml。
所述有机溶剂为二氯甲烷。所述反应在保护气体的氛围中进行。
所述反应的条件为室温下搅拌12～18h。所述丙烯酰氯通过滴加的方式加入。丙烯酰氯在加入前，将tpe衍生物、缚酸剂以及有机溶剂在冰水浴中冷却；随后滴加丙烯酰氯，冰水浴的条件下搅拌3～5小时。
所述后续处理是指通过硅胶柱色谱法后经旋转蒸发。所述硅胶柱色谱法纯化方式是：用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1(v/v)洗脱。
所述聚合物用于药物载体。
一种药物载体，由上述聚合物patc与疏水性药物制备得到。
具体制备方法为将聚合物patc溶于水中，加入疏水性药物，分散均匀，并置于4～10℃环境中处理，离心，干燥，获得药物载体。所述聚合物patc与水的用量比为30mg∶(5～30)ml。所述水为70～80℃的水。
所述聚合物patc与疏水性药物的质量比为30∶10。所述处理的时间为30～60min。
所述疏水性药物为扑热息(pa)、5-氟尿嘧啶或盐酸阿霉素。
本发明具有如下优点：
(1)本发明制备的聚合物patc具备ucst温度响应性。即当温度超过ucst时，聚合物由疏水向亲水转变，由聚集态变为解离态。通过调整聚合物中疏水性单体的比例，就能调节其相转变温度。且其温敏性有浓度依赖，会随着浓度的增加而升高，故而也可以通过调整浓度来改变相转变温度。
(2)patc中以改性后的tpe和胆酸单体作为疏水性单体，而其中胆酸衍生物为主要部分。胆酸作为一种甾体化合物，在人体内大量存在的天然分子，因而制备的聚合物具有良好的生物相容性。
(3)具有很稳定的药物包覆效果，在温度不超过相转变温度时不会发生药物的大量释放；同时也具备灵敏的温控释放性，即当温度超过相转变温度时，所包覆的药物会在短时间内大量释放出来。
(4)聚合物patc具有聚集诱导发光的荧光性质，利用该特性可以直接运用荧光成像技术实时观察聚合物相变过程，为研究聚合物相变机理提供了一种直接手段。
附图说明
图1为实施例1制备的聚合物patc的核磁氢谱图；
图2中a、b分别为实施例1制备的聚合物patc在不同浓度下透光率和荧光强度随温度的变化曲线；
图3为实施例1制备的聚合物patc在不同温度下扫描电镜(sem)图片；
图4为实施例1制备的聚合物patc的细胞毒性实验结果图；
图5为实施例1制备的药物载体在2mg/ml浓度时的药物缓释结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明的氨基改性胆酸甲酯是由胆酸甲酯和乙二胺反应制得(具体可见：h.liu，d.avoce，z.songandx.x.zhu，n-isopropylacrylamidecopolymerswithacrylamideandmethacrylamidederivativesofcholicacid：synthesisandcharacterization，macrom01.rapidcommun.，2001，22，675-680.)。
实施例中氨基改性胆酸甲酯的具体制备步骤为称取2.79g胆酸甲酯溶于30ml乙二胺中，在120℃下搅拌回流5h，后冷却到室温，并倒入4℃去离子水25ml，在室温下搅拌12h，有白色沉淀析出，经5000rpm离心得到沉淀，再经冷冻干燥后得到氨基改性胆酸甲酯。
实施例1：
(1)制备caa单体：称取2.0g氨基改性胆酸甲酯、1.72gnpa和0.902g三乙胺溶于10ml甲醇中，室温搅拌24h，再通过硅胶柱色谱法，先用乙酸乙酯∶甲醇＝20∶1(v/v)除去副产物，再用乙酸乙酯∶甲醇＝10∶1(v/v)洗脱后经45℃旋转蒸发到产物caa；
(2)制备tpea单体：称取200mgtpe单体衍生物(购自韶远科技(上海)有限公司)和75mg三乙胺溶解到8ml无水二氯甲烷中，混合物在干燥氮气氛下冰水浴中冷却，在10分钟内滴加90mg丙烯酰氯，将混合物在相同温度下搅拌4小时，然后使其逐渐升温至室温并搅拌12h，通过硅胶柱色谱法，乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1(v/v)洗脱后经45℃旋转蒸发得到白色固体tpea；
(3)制备聚合物(patc)：称取268.7mgaam、101mgcaa、9.45mgtpea、0.44mgaibn和4.23mgcmdt溶于1.2mldmso中，在室温和氮气保护下，搅拌60min，以除去体系中的空气；然后放入预热至70℃的油浴锅中，搅拌24h后迅速置于冰水中降温，再加入2.4mldmso稀释，混合物逐滴加到100ml甲醇中，经8000rpm离心得到沉淀，再经72h真空干燥得到聚合物patc；
(4)制备载药的药物载体：称取30mgpatc至10ml的80℃水中，待patc溶解至溶液澄清并持续30min，再加入10mg疏水性药物在水中并分散均匀，最后迅速置于4℃冰箱中30min，待溶液变浑浊，经8000rpm离心得到沉淀，冷冻干燥后得到药物载体。
对本实例制备的聚合物patc进行核磁测试，结果见图1，图1为氢谱图；
对本实例制备的聚合物patc进行温度响应性测试和荧光功能测试，结果见图2；图2中a、b分别为实施例1制备的聚合物patc在不同浓度下透光率和荧光强度随温度的变化曲线；图中1，2，3，4，5分别表示聚合物patc在水中的浓度，测试条件为配置成不同浓度的patc水溶液后，在具有外置加热功能的紫外分光光度计或荧光光谱仪中以0.5℃/min的速率升温并测量。结论：一方面，聚合物的相转变温度具有浓度依赖性，相转变温度随浓度的升高而升高；另一方面，其荧光强度随温度的升高而降低。
对本实例制备的聚合物patc进行扫描电镜成像，结果见图3；图3中a、b分别为实施例1制备的聚合物patc在不同温度下扫描电镜(sem)图。结论：随温度的升高，从低于相转变温度到高于相转变温度，聚合物逐渐从聚集态转变为解离态，粒径从大变小，证明了聚合物的具有高临界溶解温度性质。
对本实例制备的聚合物patc进行细胞毒性的表征，选用小数胚胎成纤维细胞(nih3t3)进行实验。首先，将nih3t3细胞接种到96孔板(5×103细胞/孔)中并在5％co2、37℃条件下培养24小时。随后，弃培养基并分别加入不同浓度patc的培养基溶液以继续培养24小时。然后，除去培养基，用pbs缓冲液洗涤细胞3次，并在每个细胞板中放置100μlcck-8工作液后，在37℃下继续培养2小时。最后，通过酶标仪在450nm处测试细胞的吸光度。结果见图4；图4为实施例1制备的聚合物patc的细胞毒性实验结果。从图4中可知，聚合物浓度在5mg/ml浓度以下都不影响细胞的增殖，说明该聚合物具有良好的生物相容性。
对本实例制备的药物载体进行药物缓释的表征，将6mg载有pa的patc均匀地分散在3ml去离子水中并转移到透析袋(mwco1000da)中；将透析袋浸入27mlpbs(0.01m，ph7.4)中，同时在100rpm，不同温度(4、25、37、43℃)下搅拌；分别在2、5、8、12、18、32、44、58、72h时，从外部释放介质中取出3ml溶液，并用等体积的新鲜pbs替换。使用uv-vis分光光度计在256nm下分析样品中的pa含量。结果见图5。从图5中可以看出，在同一浓度下，随温度升高，药物释放量从4℃时的14.6％增加到43℃时的70.4％，证明了载药聚合物药物控释的温度响应性。
实施例2：
步骤(1)、(2)同实施例1；
(3)制备聚合物(patc)：称取270.1mgaam、101mgcaa、18.9mgtpea、0.44mgaibn和4.23mgcmdt溶于1.2mldmso中，在室温和氮气保护下，搅拌60min，以除去体系中的空气。然后放入预热至70℃的油浴锅中，搅拌24h后迅速置于冰水中降温，再加入2.4mldmso稀释；混合物逐滴加到100ml甲醇中，经8000rpm离心得到沉淀，再经72h真空干燥得到聚合物patc；
(4)制备载药patc：称取30mgpatc至30ml的80℃水中，待patc溶解至溶液澄清并持续30min，再加入10mg疏水性药物在水中并分散均匀，最后迅速置于4℃冰箱中30min，待溶液变浑浊，经8000rpm离心得到沉淀，冷冻干燥后得到载药patc。本实施例制备的聚合物patc的浓度为2mg/ml时，其ucst为52℃。
实施例3：
步骤(1)、(2)同实施例1；
(3)制备聚合物(patc)：称取278.1mgaam、40.4mgcaa、3.78mgtpea、0.44mgaibn和4.23mgcmdt溶于1.2mldmso中，在室温和氮气保护下，搅拌60min，以除去体系中的空气。然后放入预热至70℃的油浴锅中，搅拌24h后迅速置于冰水中降温，再加入2.4mldmso稀释。混合物逐滴加到100ml甲醇中，经8000rpm离心得到沉淀，再经72h真空干燥得到聚合物patc；
(4)制备载药patc：称取30mgpatc至5ml的80℃水中，待patc溶解至溶液澄清并持续30min，再加入10mg疏水性药物在水中并分散均匀，最后迅速置于4℃冰箱中60min，待溶液变浑浊，经8000rpm离心得到沉淀，冷冻干燥后得到载药patc。本实施例制备的聚合物patc在浓度为2mg/ml时，其ucst为42℃。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.一种具有最高临界溶液温度和聚集诱导发光荧光性质的聚合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：以有机溶剂为反应介质，在反应介质中，胆酸衍生丙烯酰胺、四苯基乙烯衍生丙烯酰胺和丙烯酰胺在引发剂和链转移试剂的作用下共聚反应，后续处理，得到聚合物patc；
所述胆酸衍生丙烯酰胺的结构式为：
所述四苯基乙烯衍生丙烯酰胺的结构式为
2.根据权利要求1所述具有最高临界溶液温度和聚集诱导发光荧光性质的聚合物的制备方法，其特征在于：所述胆酸衍生丙烯酰胺的用量为聚合物单体摩尔量的2％-5％，四苯基乙烯衍生丙烯酰胺的用量为聚合物单体摩尔量的0.2％-1％；聚合物单体为胆酸衍生丙烯酰胺、四苯基乙烯衍生丙烯酰胺和丙烯酰胺。
3.根据权利要求1所述具有最高临界溶液温度和聚集诱导发光荧光性质的聚合物的制备方法，其特征在于：所述反应的温度为60～70℃，反应的时间为22～24h；所述反应在保护性气体的氛围中进行。
4.根据权利要求1所述具有最高临界溶液温度和聚集诱导发光荧光性质的聚合物的制备方法，其特征在于：所述链转移剂为cmdt、cppa、cdpa中一种以上；
所述引发剂为aibn。
5.根据权利要求1所述具有最高临界溶液温度和聚集诱导发光荧光性质的聚合物的制备方法，其特征在于：聚合物单体：链转移剂：引发剂的摩尔比为(300～500)∶1∶(0.1～0.3)；聚合物单体为胆酸衍生丙烯酰胺、四苯基乙烯衍生丙烯酰胺和丙烯酰胺；
所述有机溶剂为dmso。
6.一种由权利要求1～5任一项所述制备方法得到的具有最高临界溶液温度和聚集诱导发光荧光性质的聚合物。
7.根据权利要求6所述具有最高临界溶液温度和聚集诱导发光荧光性质的聚合物在载体中的应用。
8.一种药物载体，其特征在于：主要由权利要求6所述的聚合物与疏水性药物制备得到。
9.根据权利要求8所述药物载体，其特征在于：其具体制备方法为将聚合物溶于水中，加入疏水性药物，分散均匀，并置于4～10℃环境中处理，离心，干燥，获得药物载体。
10.根据权利要求9所述药物载体，其特征在于：所述聚合物与水的用量比为30mg∶(5～30)ml；所述水为70～80℃的水；
所述聚合物与疏水性药物的质量比为30∶10；
所述处理的时间为30～60min；
所述疏水性药物为扑热息、5-氟尿嘧啶或盐酸阿霉素。
技术总结
本发明属于药物载体的技术领域，公开了一种具有最高临界溶液温度和聚集诱导发光荧光性质的聚合物及制备与应用。方法：以有机溶剂为反应介质，在反应介质中，胆酸衍生丙烯酰胺、四苯基乙烯衍生丙烯酰胺和丙烯酰胺在引发剂和链转移试剂的作用下共聚反应，后续处理，得到聚合物。所述聚合物具有最高临界溶液温度和聚集诱导发光荧光性质，并具有良好的生物相容性以及很稳定的药物包覆效果，在温度不超过相转变温度时不会发生药物的大量释放；同时也具备灵敏的温控释放性，即当温度超过相转变温度时，所包覆的药物会在短时间内大量释放出来。本发明的聚合物用作药物载体。
技术研发人员：贾永光;陈凯峰;王晋;刘卅;高蒙;任力
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：.11.28
技术公布日：.02.28
