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植物DNA甲基化模式的改变不仅可以影响植物的花期、育性、花以及叶的形态等生命活动，而且在植物印记、逆境胁迫和杂种优势等方面也发挥着一定的作用。易基因小编选取3篇关于DNA甲基化在水稻植物生长中的作用研究论文，为深入研究DNA甲基化在水稻乃至植物生长发育中的分子调控机制提供一些参考。
01水稻生殖细胞中的DNA甲基化在繁殖时的SAM中就已经开始
标题：DNA methylation is reconfigured at the onset of reproduction in rice shoot apical meristem（DNA甲基化在水稻茎尖分生组织的生殖发育开始时被重新配置）
期刊：Nat Commun.
影响因子: IF 14.919
发表时间：.08.14
技术平台：WGBS、RNA-seq、小RNA-seq（smRNA-seq）
摘要：
DNA甲基化是一种表观遗传修饰，能够表征多能干细胞的基本状态，并调控干细胞向多种细胞类型的发育转变。在有花植物中，茎尖分生组织（shoot apical meristem,SAM）包含一个多能干细胞群，该类细胞群产生了包括生殖细胞在内的所有植物地上部分的组织器官。在合适条件下，SAM会经历从形成叶片的营养型SAM(SAM_Veg)到形成花序或花的生殖型SAM(SAM_Rep)发育状态转变。尽管该转变期SAM的特征会发生明显改变，但整体DNA甲基化水平变化情况仍然不清楚。本研究，作者通过分析水稻中营养型和生殖型SAM的全基因组DNA甲基化水平。结果表明与已分化的叶片相比，营养型SAM中CHH位点的甲基化始终保持在较高的水平，尤其是在转座因子（TE）区域；生殖型SAM中的甲基化水平则通过RNA依赖型的DNA甲基化通路增加。作者还发现在配子体中，高甲基化的TEs有一半已经在SAM中经历了CHH高甲基化过程。研究结果表明，早在生殖细胞分化之前，SAM就开始发生DNA甲基化变化，以此保护基因组免受有害TEs的破坏。
材料方法：
选取粳稻品种Norin 8 (N8) 进行 SAM 分析。植物在70% 湿度，27°C 下光照环境 10 小时/ 25°C 黑暗环境 14 小时循环生长，25日龄植物的全叶片用作成熟叶片。分离营养型和生殖 型SAM 。
从25日龄N8幼苗的成熟叶片中提取总DNA。在164个营养型SAM和140个生殖型SAM中提取基因组DNA进行全基因组重亚硫酸盐测序。从营养型和生殖型 SAM 的成熟叶片中分离总 RNA进行RNA-seq分析；通过电泳分离后，从凝胶中提取小于100bp的小RNA进行smRNA-seq分析。
结果
（1）CHH甲基化整体水平在生殖型SAM中增加
图1：CHH甲基化在SAM中保持整体高水平，并在生殖型SAM中增加
（2）SAM的TEs中CHH甲基化水平较高
图2：CHH 甲基化水平在蛋白质编码基因和 TE 周围不同
图3：CHH 高甲基化主要发生在 TE 区域
表1：与 DMR 重叠的转座因子
（3）RNA介导的DNA甲基化（RdDM）促进SAM的 CHH 高甲基化
图4：RdDM通路在水稻SAM中有活性
图5：生殖细胞中许多高甲基化的TE在SAM中经历了CHH高甲基化
02 DNA超甲基化对水稻缺铁响应的表观遗传调控机制
标题：DNA methylation is involved in acclimation to iron-deficiency in rice (Oryza sativa)（DNA甲基化参与水稻（Oryza sativa）对缺铁的响应）
期刊：The Plant Journal
影响因子: IF 6.417
发表时间：.05.12
技术平台：WGBS、RNA-seq、小RNA-seq（smRNA-seq）
摘要：
铁（Fe）是植物必需的微量营养元素，缺铁对植物生长、产量和食物品质有重要影响。目前关于水稻缺铁的研究主要集中在调控铁稳态的功能基因的挖掘及基因调控关系方面，而表观遗传修饰在水稻响应缺铁环境时所扮演的角色尚不明确。研究人员通过对在缺铁和正常环境下生长野生型水稻（WT）的根和地上组织进行全基因组甲基化测序（WGBS）分析和对应的mRNA、小RNA进行高通量转录组RNA-seq关联分析。结果表明，水稻在经历缺铁后会在基因附近产生大量以CHH类型为主的超甲基化区域，且普遍出现在转座因子（TE）区域。通过对缺铁响应基因的转录变化与DNA甲基化变化关联分析，研究人员进一步发现，调控铁响应基因的铁信号通路核心转录因子OsbHLH156和IRO2在缺铁条件下发生了显著的差异甲基化，表明缺铁诱导基因的转录丰度与附近的 TE 呈负相关，与24-nt siRNAs呈正相关。通过外源施用 DNA 甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷（Aza）研究甲基化变化对缺铁水稻的生理和分子反应的影响，并针对全基因组CHH类型甲基化水平显著降低的osdrm2突变体进行了与Aza实验相同的表型分析和基因表达分析，两种方法都促进水稻生长和铁含量下降。因此，由siRNA 指导的特定甲基化模式的改变在水稻适应缺铁条件中起重要作用，可能是一种适应有限营养供应的普遍机制。
材料方法：
本研究将水稻（Oryza sativa L.cv Nipponbare）种子在自来水中受精2天，然后在昼夜温度30/22℃，光周期12小时条件下生长。注入含铁（+Fe）或不含铁（-Fe）的水培营养液，包括0.51 mM K2SO4、1.64 mM MgSO4、0.32 mM NaH2PO4、1.0 mM CaCl2、1.43 mM NH4NO3、9μM MnCl2、0.13μM CuSO4、0.02μM H3BO3、0.08μM（NH4）6Mo7O24、0.15μM ZnSO4、0.25 mM Na2SiO3和125μM EDTA Fe。将溶液的pH值调整至5.5-5.6，每3天更换一次溶液。从幼苗中分别收集发芽后经10天水培生长的水稻根和芽，添加或不添加铁，提取分离基因组DNA和RNA用于甲基化组和转录组实验。每个样本进行三个生物学重复。
结果：
研究人员通过对在缺铁和正常环境下生长野生型水稻（WT）的根和地上组织进行全基因组甲基化测序（WGBS）分析发现，水稻在经历缺铁后会在基因附近产生大量以CHH类型为主的超甲基化区域，且普遍出现在转座子（TE）区域。
通过对缺铁响应基因的转录变化与DNA甲基化变化关联分析，研究人员进一步发现，调控铁响应基因的铁信号通路核心转录因子OsbHLH156和IRO2在缺铁条件下发生了显著的差异甲基化。
为了验证DNA甲基化变化在水稻应对缺铁环境的作用，研究人员通过外源施用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷（Aza），研究了甲基化变化对缺铁水稻的生理和分子反应的影响。结果发现Aza处理使得水稻铁信号通路核心转录因子的DNA甲基化水平降低，植株生长和铁含量降低。考虑到Aza处理可能对水稻造成未知的毒性，本研究还针对全基因组CHH类型甲基化水平显著降低的osdrm2突变体进行了与Aza实验相同的表型分析和基因表达分析，结果支持了Aza处理的有效性和可靠性。
综上所述，该研究揭示了水稻通过提高特定区域DNA甲基化水平以适应缺铁环境的机制，并提出通过影响铁信号通路核心转录因子表达进而影响铁稳态的可能。该研究为培育抗缺铁水稻材料提供了新思路。
03 WGBS揭示水稻在干旱和盐胁迫下的DNA甲基化变化
标题：Bisulphite sequencing reveals dynamic DNA methylation under desiccation and salinity stresses in rice cultivars（WGBS测序揭示水稻在干旱和盐胁迫下的DNA甲基化变化）
期刊：Genomics
影响因子: IF 5.736
发表时间：.09
技术平台：WGBS、RNA-seq
摘要：
先前研究已鉴定正常生长条件下不同水稻品种之间的DNA甲基化模式和甲基化差异，包括胁迫敏感（IR64），耐旱（Nagina 22）和耐盐（Pokkali），不同品种之间的甲基化差异主要出现在CG位点。为进一步了解DNA甲基化在干旱和盐度胁迫下的作用，作者通过全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）分析了三组水稻品种（IR64，Nagina 22，Pokkali）在干旱和盐胁迫条件下DNA甲基化的作用。基因组CG位点中的甲基化和远端启动子区域CHH位点中的甲基化与基因表达正相关。Nagina 22中的低甲基化、Pokkali响应干旱和盐度胁迫的高甲基化分别与少数非生物胁迫应急响应相关的基因高表达相关。大多数差异甲基化区域和差异表达基因（DMR-DEGs）具有品种特异性，表明DNA甲基化在水稻非生物胁迫响应中以品种特异性的方式起重要作用。此外，作者鉴定了因启动子区域和/或编码区域中敏感和耐受品种DNA多态性而具有差异甲基化胞嘧啶的DMR-DEGs，表明表位基因在非生物胁迫响应中的作用。
材料方法：
作者分析了三种对非生物胁迫具有对比反应的水稻品种，包括耐干旱的Nagina 22，耐盐的Pokkali和对两种胁迫条件敏感的IR64。将两周龄水培生长的水稻幼苗IR64和Nagina 22用用纸巾折叠包裹3小时作干旱处理。将幼苗放在浓度为200mM的NaCl溶液中3小时来作盐胁迫处理，胁迫处理的幼苗与对照组幼苗一起在水中保持相同的持续时间。收获胁迫处理的幼苗，在液氮中快速冷冻并储存在−80°C。提取基因组DNA并进行全基因组重亚硫酸盐测序分析和相对应的转录组分析。
结果：
本研究对IR64、Nagina 22 和 Pokkali三种水稻品种在胁迫处理后的 DNA 甲基化变化进行测序分析，并与对照条件进行比较。采用WGBS联合相对应的RNA-seq测序分析鉴定了三组水稻幼苗暴露于干旱胁迫和盐胁迫的全基因组DNA甲基化变化、蛋白质编码基因和TEs中的DNA甲基化、DNA甲基化对基因表达的影响、水稻幼苗在非生物胁迫下的差异甲基化区域、干旱胁迫和盐胁迫条件下差异甲基化与差异基因表达的相关性，并验证了差异甲基化与DNA多态性在非生物胁迫反应中的作用。总体而言，本研究证明了DNA甲基化在水稻非生物胁迫反应中的特异性作用。
图：干旱胁迫条件下差异甲基化与差异基因表达的关联分析
图：盐胁迫条件下差异甲基化与差异基因表达的关联分析
易基因小结
DNA甲基化作为一种重要的非永久性但相对长期可遗传的基因修饰，通过调控基因表达、沉默转座子和染色体相互作用影响植物的多种生命活动，并在植物逆境胁迫、基因组印记等方面起到一定的作用，同时可以通过这种表观遗传修饰能够产生植物的新表型，丰富生物的多样性。随着植物转录组学和甲基化组学的应用，今后研究将从分子以及细胞水平上阐明DNA甲基化的动力学和遗传学及其分子调控机制，在基因表达层面上探究植物的生长发育及抗逆性机理，从而为植物优良新品种的培育和遗传改良研究提供更多表观遗传修饰方面的理论依据。
关于植物DNA甲基化研究
（1）植物中的DNA甲基化
对于植物而言，面对生长环境的改变，表观遗传的变异会改变植物DNA的构象，从而改变染色质和蛋白质的结构，达到调节基因组的作用。研究发现，当植物面临生物胁迫和非生物胁迫时，植物基因组中DNA甲基化会发生改变，并且这些改变会遗传给后代。所以DNA甲基化的改变能够丰富植物物种的多样性，加强植物的环境适应性。
不同于哺乳动物基因组只有CG甲基化，植物基因组甲基化有CG，CHG，CHH（H代表任何非G的碱基）甲基化。而维持这三种不同的DNA甲基化的分子机制非常复杂。
（2）植物中的DNA甲基化研究技术
（3）植物DNA甲基化研究思路
植物DNA甲基化一般遵循三个步骤进行数据挖掘。首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。最后，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。
参考文献：
DNA methylation is reconfigured at the onset of reproduction in rice shoot apical meristem | Nature Communications
DOI:10.1111/tpj.15318
浙江大学：植物所寿惠霞课题组在Plant Journal发文揭示水稻缺铁响应的表观遗传调控机制
DOI:10.1016/j.ygeno..04.005
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