第七次霍乱大流行致病弧菌的两个防御系统

背景

霍乱是由霍乱弧菌感染所导致的疾病。目前霍乱弧菌家族成员较多，根据血清分型包括H抗原和O抗原，其中根据O抗原的不同又可以分为多个血清群，目前能引起霍乱的主要是O1群和O139群。全球至今已出现七次霍乱大流行，目前正在经历的第七次主要由Vibrio cholerae El Tor 菌株(O1群)引起。环境弧菌转变为致病的弧菌是由于获取了一系列的基因组岛，包括含有编码霍乱毒素的噬菌体(CTXϕ)、弧菌致病岛 (VPI-1 和VPI-2)、第七次霍乱弧菌所特有的的基因组岛(VSP-I和 VSP-II)。

致病机理：霍乱弧菌分泌霍乱毒素，该毒素作用于肠细胞膜表面上的受体（由神经节苷脂GM1组成），其B亚单位与受体结合，使毒素分子变构，A精致单位进入细胞，A1肽链活化，进而激活腺苷环化酶（AC），使三磷酸腺苷（ATP）转化为环磷酸腺苷（cAMP），细胞内 cAMP浓度增高，导致肠粘膜细胞分泌功能大为亢进，使大量体液和电解质进入肠腔而发生剧烈吐泻，由于大量脱水和失盐，可发生代谢性酸中毒，血循环衰竭，甚至休克或死亡(摘自百度百科)。

文章概述

来自瑞士洛桑联邦理工学院Melanie Blokesch等人于4月6日在《NATURE》上发表了题为"Two defence systems eliminate plasmids from seventh pandemic Vibrio cholerae"的研究论文。由噬菌体和质粒所驱使的水平基因传播(HGT)可引发细菌快速进化。随之而来细菌也会进化出一系列的机制来抵御外敌的入侵，例如我们熟知的CRISPR–Cas 和 Argonaute系统。质粒常见于各种细菌，相比于环境霍乱菌株，引发霍乱的菌株中质粒却比较少，由此推测这些致病菌株中存在未被发现的防御系统。文章主要针对第七次霍乱爆发的致病菌株进行了分析，发现了存在致病基因组岛上的两种DNA防御系统DdmABC和DdmDE，两个系统可独立或协同作用，通过降解小的多重拷贝质粒来到达快速清除质粒的目的，DdmABC系统可以引发自杀机制来抵御噬菌体的入侵。此外，DdmABC系统增加大型质粒维持的负担，通过一种类似自杀机制来实现对质粒携带菌株的反向选择。实验结果很好的回答了长期存在的问题：为什么环境菌株含有更丰富的质粒，但是致病菌株中却罕见。同时也为抗性质粒的传播提供新的认识，并就两种防御系统之间的相互作用如何塑造最成功的大流行霍乱弧菌谱系的演变提供新见解。

结果分析

第七次霍乱致病菌存在质粒不稳定的现象

为了确定质粒是否能稳定存在于霍乱致病菌，文章中选取了第七次霍乱致病菌(O1 El Tor biotype ,7PET)的代表株系A1552进行了验证。分别使用了在大肠杆菌(ColE1/pMB1/pBR322/pUC-family plasmid pBAD/Myc-HisA (pBAD))和环境弧菌本底的质粒(pSa5Y)做测试，发现在缺少筛选条件的情况下，随着传代次数增加，质粒均会逐渐丢失(Fig. 1a, b)。为了再次评估质粒pSa5Y的稳定性，又选取了环境弧菌、致病弧菌进行测试，研究发现仅致病O1 El Tor菌株(O1群)的质粒不能稳定存在，但是对于环境弧菌和致病弧菌O139群却能稳定存在(Fig. 1c)。关于环境弧菌本底的质粒(pSa5Y)其拷贝数为4-5个，相对较低，于是又对质粒进行改造，更换了不同类型的复制子，发现即使拷贝数发生变化，但是对于A1552菌株而言其质粒均不能稳定存在(Fig. 1d)。

Fig1 Plasmids are unstable in V. cholerae O1 El Tor

两个防御系统的发现

通过对质粒稳定性实验结果的分析，发现同为致病菌的O1和O139群对于质粒稳定性却表现出较大差异，其中O139群能够稳定的持有pSa5Y质粒。通过对致病弧菌基因组岛的分析，发现O139群含有一个截断的VPI-2序列(28个基因缺失)(Fig. 2a)，但是O1群含有完整的序列，可能是由于这缺失的28个基因发挥了抵御功能，因此针对该缺失序列进行单敲及回补实验，最终定位到双基因的操纵子VC1771–VC1770，在质粒去稳定性中协同作用(Fig. 2c–e)。但是仅仅只有这两个基因发挥作用吗？通过对于其他弧菌序列分析，发现即使存在完整VPI-2序列(VC1771–VC1770表达水平与A1552一致)，质粒也能稳定存在，这也就意味着在致病菌O1群中还存在其他的防御系统。

由于防御系统常富集于基因组岛附近，所以通过对第七次霍乱致病菌(O1 El Tor biotype ,7PET)的代表株系A1552所特有的基因组岛进行敲除分析，发现VSP-II的缺失导致质粒能够稳定存在于大多数菌株中。通过类似的单敲及回补实验，最终定位到VSP-II上的三基因的操纵子VC0492–VC0490，在质粒去稳定性中可能协同作用(Fig. 2i–k)。

两个防御系统之间有什么关系呢？基于敲除实验分析，我们发现VC1771或VC1770的敲除导致质粒消除能力几乎完全丧失，但是VC0492–VC0490的敲除发现其消除能力并没有完全丧失，推测这两个防御系统是一起工作的，其中VC0492–VC0490可能用于增强VC1771–VC1770系统活性或者其他方式。VC0492–VC0490和VC1771–VC1770作为DNA防御系统进行重命名DdmABC和DdmDE。

Fig2V. choleraeO1 El Tor contains two plasmid defence systems on pathogenicity islands

防御系统的工作模式

为了确定两种防御系统工作模式，创建了防御系统单敲及双敲的弧菌，并分别导入阿拉伯糖诱导的操纵子防御系统(TnddmABC和TnddmDE)，发现都可以消除pSa5Y质粒，同时在双敲除背景之下，导入DdmDE系统可以完全消除质粒，但是DdmABC系统消除效率较低，这可以说明两个防御系统可以独立工作(Fig. 3a)。

为了测试防御系统的异源菌株消除活性，将两个防御系统分别导入大肠杆菌中，测试对含有不同复制子的pSa5Y质粒的消除效率，结果表明DdmDE质粒消除活性不依赖于质粒的复制模式，但是对于DdmABC系统而言不影响质粒的稳定性存在(Fig. 3b)。同时发现在质粒存在情况下，高浓度阿拉伯糖诱导的DdmABC系统会导致弧菌及大肠杆菌的生长缺陷，说明该系统的工作具有质粒依赖性并且在缺失DdmDE系统下该毒性得到了增强(Fig. 4a–c)。两种防御系统是否也会消除噬菌体呢？于是针对5种噬菌体在大肠杆菌中进行了测试，发现DdmDE系统没有提供明显保护，但是DdmABC系统可以有效针对噬菌体λ和P1(Fig. 3c)。基于前期发现DdmABC系统具有质粒依赖的活性，于是推测该系统主要通过一种自杀机制来控制噬菌体的入侵。结果表明在低感染复数(MOI)的情况下，DdmABC系统提高强有力的保护，菌群数量持续增长，但是在较高感染复数(MOI)的情况下，几乎所有菌群都被感染，因此在噬菌体诱导裂解之前的20分钟启动了自杀机制。

为了进一步研究Ddm系统的活性，构建了荧光标记的pSa5Y-parSMT1质粒，在防御系统单敲及双敲的弧菌中进行了测试，结果表明两种防御系统均能消除质粒，其中DdmDE系统消除效率较高，但是DdmABC系统的消除效率较低，同时引发形成大的质粒簇(Fig. 3e)。DdmDE系统消除质粒效率高，即使抑制细胞分裂其消除效率不受影响，这暗示着该系统很大可能是通过降解质粒来消除。相反，对于DdmABC系统而言，抑制细胞分裂显著增强质粒依赖的细胞毒性，可能是因为无法分裂细胞导致质粒不能通过稀释而被逐渐丢失(Fig. 4a–b)。根据以上数据结果，分析得出DdmDE系统通过降解质粒来消除，并且通过DdmABC系统得以增强。通过对防御系统相关结构域的的单氨基酸的替换，发现质粒消除能力丧失(Fig. 3f–i)。

Fig3 Mode of action of the DdmDE and DdmABC systems

Fig4 Production of DdmABC leads to plasmid-dependent toxicity inV. choleraeandE. coli

Fig5 Plasmid elimination by DdmDE is rapid and does not depend on cell division, and cell division inhibition enhances

plasmid-dependent toxicity by DdmABC

DdmABC系统的反向选择

为了进一步研究防御系统与生态的相关性和霍乱弧菌的进化，使用不同质粒在WT和防御系统双敲的A1552菌株中进行了验证，发现小型质粒都不能稳定存在，但是对于大型质粒没有受到防御系统的影响(Fig. 6a)。那么防御系统是否会影响质粒获取呢？于是将大型质粒进行了转化实验，发现两种防御系统都会降低质粒的获取(Fig. 6b)。为了研究大型质粒的稳定性，选取了pVCR94大型质粒进行进一步验证，将WT、防御系统单敲的菌株进行竞争性实验，发现质粒携带的菌株呈现出DdmABC系统依赖的竞争缺陷(Fig. 6c)，正如推测所言DdmABC在识别质粒的过程中会产生小而持续的生长缺陷，导致在竞争实验中不敌无质粒的菌株，从而实现防御系统通过产生类似的自杀机制对于菌株进行反向选择。

作为具有广泛宿主的多重耐药的 IncC质粒的成员pVCR94，是目前已知的能稳定存在于第七次霍乱致病菌的质粒。非洲霍乱流行期间抗生素的广泛使用与 IncC 多重耐药质粒的扩散有关，基于该质粒存在的稳定性，推测该质粒将被维持。但是目前多重耐药的霍乱弧菌更多的是携带 SXT/R391 家族整合结合元件 (ICE) ，竞争实验表明携带ICE的菌株更具优势(Fig. 6d)，这也说明DdmABC系统反向选择导致从多重耐药的质粒到ICEs的转换。

Fig6 Effect of the DdmDE and DdmABC systems on V. cholerae 7PET ecology.

写在最后

总体而言，文章揭示了两种存在于致病基因组岛上的防御系统，可独立或协同抵御质粒或噬菌体的入侵，同时揭示了防御系统的工作模式。此外，该工作也说明了另外一个问题，为什么环境弧菌能广泛接收各种质粒，但是对于致病菌而言较少。

参考来源

Jaskólska, M., Adams, D.W. & Blokesch, M. Two defence systems eliminate plasmids from seventh pandemic Vibrio cholerae. Nature 604, 323–329 (). /10.1038/s41586-022-04546-y