单细胞转录组（scRNA-seq）可以提供单细胞水平上基因表达的信息，近些年已在细胞谱系、细胞功能、细胞分化以及细胞应答等方面开展了大量研究，提升了我们对复杂生物机制的认知，其中有肿瘤和疾病的发生、免疫机制、神经系统和胚胎发育等。
随着植物单细胞测序技术挑战的克服，陆续有许多植物单细胞转录组的研究发表出来。下面这篇近期发表在Plant Biotechnology Journal期刊上的文章中，中国农业科学院蔬菜与花卉研究所的研究员们利用单细胞转录组（scRNA-seq）对白菜叶片的腹背面细胞进行细胞分化机制的研究，值得我们学习。
研究背景
叶肉细胞是光合作用的主要部位，也是叶片中最多的细胞群，腹面有紧密排列的圆柱状栅栏状叶肉细胞（PMCs），背面有松散排列的圆形海绵状叶肉细胞（SMCs）。研究显示PMCs和SMCs的腹背侧分化缺失会导致叶形的变化。芸苔属植物包括许多形态多样性极端的多叶蔬菜，如头叶白菜和平叶白菜。探索PMCs与SMCs的分化，识别关键调控基因，对于阐明蔬菜作物叶片发育和抽穗的机制具有重要意义。
研究材料：莲座期白菜幼叶原生质体
研究结果
作者从莲座期白菜幼叶制备原生质体，然后进行单细胞转录组（图1a）。去除低质量的细胞和基因后，作者获得了16055个高质量的细胞和30214个基因。scRNA-seq数据显示了较高的重复性，并与bulkRNA-seq数据有很强的相关性（图1b,c）。细胞被分为17个簇（图1d）。利用拟南芥同源的标记基因，鉴定了8种细胞类型，有叶肉细胞（MCs）、表皮细胞、脉管系统、维管束鞘、保卫细胞、增殖细胞、韧皮部和木质部（图1d,e）。保卫细胞标记基因Bra001929的表达与原位RT-PCR检测结果一致。
为了进一步验证注释结果，作者将注释结果与拟南芥叶片scRNA-seq数据集进行了比较。两个物种之间的细胞类型的两两比较和scRNA-seq数据的整合分析都支持作者的注释。
由于MCs没有分为PMCs和SMCs，作者开发了一种优化的tape-sandwich方法来特异性富集PMCs和SMCs，以识别特定的标记基因来区分它们。作者利用RNA-seq鉴定了6731个差异表达基因（DEGs）。基于此前拟南芥叶子腹背面的许多可靠DEGs，作者分别从B. rapa和拟南芥共享的重叠同源DEGs中分别选择了433个和510个潜在的PMC和SMC标记基因。
除了鉴定出许多与光合作用相关的基因外，大量的核糖体蛋白编码基因（rpgs）（239/944）在PMCs中富集（图1q,r）。在发现的239个rpeg中，有27个是15个参与正向细胞或PMCs发育的拟南芥RPEGs的同源基因。蛋白-蛋白相互作用分析显示，PMCs中连接最多的前10个基因是rpeg（图1s）。这些结果强有力地表明，RPEGs参与了PMCs的发育。与PMCs不同，SMCs主要富集于对非生物和生物刺激的响应、信号响应基因（温度、茉莉酸、水杨酸和钙）和蛋白质修饰中（图1t）。总而言之，这些结果表明PMCs是光合作用的主要机器，而SMCs可能参与调节机器以适应外部环境。
大白菜腹面叶和背面叶肉细胞的鉴定
作者发现大部分报道的腹背面极性基因几乎在MCs中检测不到。作者收集了一系列代表茎尖分生组织（SAM）和幼苗期和莲座期内外叶的不同区域的样本RNA-seq。结果显示大部分腹背面极性基因优先在SAM中表达，而在这两个时期它们的表达从内到外的叶片都被急剧而持续地下调。采集的是中期的莲座叶用于scRNA-seq，这可能是为什么在MCs中检测到很少的腹背面极性基因的原因。
◆研究总结◆
该研究生成了一个单细胞分辨率的大白菜莲座叶转录组图谱。一个关键的发现是从MCs中鉴定出了腹面PMCs和背面SMCs。另外，还确定了PMC和SMC之间的功能差异，以及RPEG在PMC发展中的潜在作用。该研究还提供了许多细胞类型特异性的标记基因，这将有助于scRNA-seq在白菜中的应用。比较聚焦SMCs和PMCs的每种细胞类型的叶片单细胞转录组，跨越不同发育阶段和亚型拓展了我们对PMCs和SMCs在叶片腹背面模式以及叶片发育和形态发生过程中的差异的了解。
文献下载链接：
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提取码：zn1x
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