撰文 | YQ
责编 | 翊竑
近年来CRISPR-Cas9作为一种新的便捷的基因编辑手段，大大降低了基因编辑所需要的门槛，在分子生物学等领域得到了广泛的应用，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier也因此获得度诺贝尔化学奖。基于CRISPR-Cas9的临床应用也在近年被不断报道。在治疗HIV，白血病，中性粒细胞减少症，单纯疱疹病毒性角膜炎，杜氏肌营养不良等疾病上都取得了令人振奋的结果。不过，喜忧参半，CRISPR-Cas9作为一种外源导入的基因编辑系统，在基因编辑过程中，会造成DNA断裂，包括但不限于诱发基因损伤修复过程、导致染色体大片段缺失等安全隐患，同时其脱靶效应也存在较大的争议。
多项研究表明，CRISPR-Cas9系统能激活p53通路并促进p53失活型突变细胞的选择性富集，提示了目前我们对该系统在临床应用上风险的认识仍有不足。对于CRISPR-Cas9系统是否能够在细胞中促进p53失活型突变的选择性富集的普遍性，是否一些特定基因的CRISPR-Cas9编辑更容易促进p53失活型突变的选择性富集仍不明确。此外，其他的一些促癌基因或者抑癌基因的突变是否也会在CRISPR-Cas9系统基因编辑的时候被富集也尚未有系统性的研究。
近日，来自美国National Cancer Institute的Eytan Ruppin课题组，在Nature Communications上发表了题为A systematic genome-wide mapping of oncogenic mutation selection during CRISPR-Cas9 genome editing的文章，详细地对上述问题进行了研究，报道了在应用CRISPR-Cas9系统做基因编辑的过程中具有癌症相关基因突变的细胞会被富集这一现象较为普遍，提示了我们将CRISPR-Cas9应用于临床时候应该慎重。
作者首先通过对比大量的p53WT 以及突变型p53细胞系的CRISPR-Cas9以及shRNA筛选的结果，作者发现与shRNA筛选系统相比，CRISPR-Cas9基因敲除系统能够在大量的恶性细胞系促进突变型p53细胞的富集，这一现象也存在于大量的未转化的细胞系中，说明了该现象的普遍性。另外，作者发现，在CRISPR-Cas9基因敲除筛选时，p53WT细胞中更依赖的基因（CRISPR- specific differentially essential positive (CDE+) genes）更倾向于位于染色质的脆性位点（common fragile sites）。同时这些基因富集于DNA damage response, DNA repair, 及 Fanconi anemia通路，提示了这些基因确实与p53蛋白的功能有关。作者进一步对前述挑选出来的并经过校正后的CDE+基因使用CRISPR-KO以及CRISPR-i系统做了进一步验证，同时作者也使用了非慢病毒介导的直接递送Cas9-RNP的方式对这些基因做了验证，证实了无论是慢病毒介导的CRISPR-Cas9敲除还是瞬时的递送介导的敲除都会促进p53突变型细胞的富集，进一步的竞争实验也证实了这一结论。
图1. CDE+基因p53 WT以及p53 mutant细胞CRISPR-KO以及CRISPRi竞争实验
作者进一步对CRISPR-KO是否可以促进其他的与癌症发生发展息息相关的基因突变的细胞富集做了系统性的分析，发现KRAS、p53以及VHL等基因可能会被富集，作者对其中的KRAS做了详细的如上述p53类似的实验验证，证实了KRAS突变也会在大量的不同类型的细胞的CRISPR-KO基因编辑过程中被富集，说明了作者分析方法的可靠性。与p53类似，与KRAS相关的CDE-基因也富集于细胞周期、细胞DNA损伤修复以及基因转录过程。
图2. KRAS CDE-基因富集分析结果
综上，作者通对CRISPR-KO促进与癌症发生发展息息相关的基因的突变细胞的富集的系统性的分析，并通过相关的功能实验，进一步证实了p53突变型细胞在CRISPR-KO中会被富集，并且这一现象比之前认为的更为广泛，存在于多种类型的细胞，包括恶性转换以及非恶性转化的细胞中，也不局限于慢病毒介导的CRISPR-KO，在瞬时递送的系统中也存在这一现像。另外，作者还发现了CRISPR-KO促进与癌症发生发展息息相关的基因的突变细胞的富集不仅局限于p53基因，其他的一些基因也存在类似的效应。因此，尽管 CRISPR基因编辑在临床应用中已经取得了一些令人兴奋进展，但是其风险性也值得引起大家的重视，需要对其风险性以及副作用做详细的研究，才能足够安全地用于患者。
原文链接：
/10.1038/s41467-021-26788-6
