作者：追风
CRISPR-Cas系统为微生物提供对感染性核酸的适应性免疫，并被广泛用作基因组编辑工具。但有矛必有盾，在与细菌的军备竞赛中，噬菌体也进化出了CRISPR-Cas蛋白抑制剂，称为Anti-CRISPR(Acr)。
3月18日，CRISPR领域大牛、Acr的开发者之一、麻省大学医学院Erik J. Sontheimer在Annual Review of Biochemistry撰写了“Anti-CRISPRs: Protein Inhibitors of CRISPR-Cas Systems”的综述。与Joseph Bondy-Denomy在Nature Methods发表的综述偏重介绍Acr的应用不同，本文主要回顾了Acr的发现历程及作用机制，两篇综述可互为补充。因此介绍其中主要内容，以飨读者。
图1：Acr蛋白在不同阶段抑制不同的CRISPR-Cas系统
Acr的发现历程
1. Acr的最初发现
Acr首次被发现是作为对铜绿假单胞菌(Pae)菌种中前驱体影响的调查的一部分。当细菌病毒(也称为噬菌体)将其完整基因组整合到宿主基因组中时，就形成了原噬菌体。原噬菌体形成是噬菌体的一个常见特征。虽然前噬菌体中的大多数基因是沉默的，但保持表达的基因通常会引发深刻的生理效应。Bondy-Denomy等人构建了一个菌株集合，每个菌株包含一个不同的原噬菌体，以努力系统地研究它们的表型效应。利用这一收集，他们发现了三个前噬菌体，它们介导了在研究中的Pae菌株中存在的I-F型CRISPR-Cas系统的抑制。通过将这些噬菌体的基因组与相关噬菌体的基因组进行比较，在8个不同的噬菌体中发现了一个潜在的含有抗CRISPR(Acr)基因的区域。
最终，确定了编码五个完全不同的Acr蛋白家族(AcrIF1-AcrIF5)的基因，它们抑制了I-F系统。随后的研究发现，位于同一噬菌体Acr区域的基因编码另外四个Acr家族(AcrIE1-AcrIE4)。这些Acr抑制某些Pae菌株编码的I-E CRISPR-Cas系统。值得注意的是，在这九个新发现的家族中，所有蛋白质的长度都小于140aa，并且没有显示出与其他推定的或已知的蛋白质的序列相似之处。
2. 利用Aca的保守性发现新Acr
使用最初9个家族的Acr蛋白进行蛋白质序列数据库搜索，作为PSI-BLAST查询只发现了在假单胞菌属内编码的密切相关的同源物，这使得鉴定其他Acr家族具有挑战性。通过观察到一个被称为Acr相关基因1(Aca1)，在每个Acr区域的3端是保守的，从而能够利用保守的Aca1序列来比对新的Acr位点(图2a)。Aca1蛋白含有一个预测的螺旋-转角-螺旋(HTH)DNA结合域，表明它可能是Acr操纵子的调节因子。通过对Aca1蛋白进行PSI-BLAST搜索，通过鉴定在前噬菌体和其他类型的MGEs中的Aca1同源物上游编码的小基因，发现了额外的Acr。对其中一些候选者进行的体内活性分析显示，另外两个ACR家族抑制了Pae的I-F系统(AcrIF6和AcrIF7)。幸运的是，AcrIF6家族作为第一个在各种各样的细菌物种中包含不同同源物的家族出现了。出乎意料的是，一个AcrIF6同源基因编码在一个不包括Aca1基因的前噬菌体区域。然而，在编码该Acr的基因下游编码的蛋白含有一个预测的HTH DNA结合域。这个新的假定的DNA结合蛋白的同源物，命名为Aca2，被发现编码在编码其他小蛋白的下游，这些小蛋白后来证明具有Acr活性。这种方法产生了另外三个Acr家族，它们对Pae I-F系统(AcrIF8-AcrIF10)具有抑制活性(图2b)。对这些新家族成员的PSI-BLAST搜索在细菌物种中发现了与I-F系统本身一样广泛分布的同源物，这表明Acr有可能抑制大多数已知的I-F系统。
使用Aca2作为查询的进一步的PSI-BLAST搜索在Brackiella oedipodis和脑膜炎奈瑟氏菌(Nme)菌株中的MGEs中鉴定出假定的Acr。实验揭示了三个Acrs家族(AcrIIC1-AcrIIC3)可以抑制NmeCas9。令人兴奋的是，这些Acrs也被证明能抑制培养的人类细胞的基因组编辑。
图2：发现Acr蛋白所用的方法
3. 通过生物信息学进一步发现新Acr
除了上面描述的关联推定方法，另一种计算方法，自我靶向（Self-targeting）的方法，在识别新Acr方面取得了丰硕的成果(图2c)。这种方法包括搜索编码功能性CRISPR-Cas系统和CRISPR间隔区的细菌基因组，这些间隔区以同一基因组内的位点为靶点。除非它们的基因组也编码Acr以抑制它们的CRISPR-Cas系统，否则这些菌株将无法存活。Rauch等人鉴定了具有自定位间隔区的单核细胞增生李斯特菌(Lmo)菌株，在其中一个菌株中，他们还鉴定了一个靶向原噬菌体，并表明该前驱体具有Acr活性。随后将该噬菌体基因组与一个不具有Acr活性的密切相关噬菌体基因组进行比较，有助于鉴定编码两种蛋白(AcrIIA1和AcrIIA2)的Acr区域，这两种蛋白有效地抑制了II-A型Lmo CRISPR-Cas系统。用这些Acr进行BLAST搜索得到了更多的前噬菌体Acr区域，并鉴定出另外两个Acr家族，AcrIIA3和AcrIIA4。重要的是，AcrIIA2和AcrIIA4能够抑制SpyCas9系统，这是迄今为止用于基因组编辑应用最广泛的系统。
在Watters等人随后的研究中，对150,000个原核基因组的系统搜索确定了超过9,000个基因组(150,000个基因组中的6%)具有自定位间隔区(∼6%)。通过对具有V-A型CRISPR/Cas12系统的Moraxella Bovoculi自靶向菌株的研究，发现Acrs对该系统(AcrVA1、AcrVA4和AcrVA5)有抑制作用。同时进行的关联推定方法也在卡他摩拉氏菌(AcrVA1-AcrVA3)菌株中发现了V-A型Acr。这些发现之所以引人注目，是因为V型Cas12系统正越来越多地被用于基因组编辑应用。
4. 通过功能筛选和选择发现新Acr
在Acr鉴定的纯功能方法中，Hynes等人使用数百个感染嗜热链球菌(Sth)的噬菌体的集合，来鉴定不能诱导基于CRISPR-Cas的免疫的噬菌体。其中一个噬菌体被证实能抵抗CRISPR-Cas攻击，即使在感染产生针对噬菌体基因组的间隔区的细胞时也是如此。通过克隆和表达该噬菌体的所有基因，发现了一种称为AcrIIA5的基因，它抑制了Sth和Spy CRISPR-Cas9系统的II-A型系统。随后的研究使用相同的功能方法结合基因邻域分析确定了AcrIIA6。通过分离对CRISPR-Cas敏感的病毒突变体，还发现了一种Acr，它能抑制该物种的I-D系统。这种名为AcrID1的Acr是到目前为止识别的唯一类型的I-D Acr。
利用类似方法，鉴定了4个编码蛋白(AcrIIA7-AcrIIA10)的基因，这些基因在体外可以抑制SpyCas9 DNA的切割活性。这四个假定的A中有三个在体外也与SpyCas9强健结合。
与其他已鉴定的Acr相比，AcrIIA7和AcrIIA9的同源物在不同的细菌门中分布更广泛。令人惊讶的是，这些同源物在编码发现时涉及的相同亚型(在本例中为II-A型)的CRISPR-Cas系统的物种中没有富集，这是其他Acr家族的一致特征。
5. 小分子Acr
由于Cas9抑制剂在基因组编辑应用中的许多实际应用，一些研究人员将重点放在开发小分子Cas9抑制剂上，因为这些抑制剂比蛋白质有一些优势。Maji等人生成了一个平台来筛选大的小分子文库，以识别SpyCas9的抑制剂。这个高通量平台使用基于荧光偏振的DNA结合分析来筛选小分子文库。一种名为BRD0539的分子被鉴定为SpyCas9抑制剂，它在人血浆中稳定。该分子在体外证明了SpyCas9在细菌和哺乳动物细胞中的剂量和时间控制。这种方法可能对识别其他现有的和新兴的CRISPR相关核酸酶的小分子抑制剂很有用。
Acr的作用机制
在过去的四年里，描述了16种不同Acr的详细生化和结构特征的研究已经发表。这些结构中的一半以上至少解决了两次，有些甚至解决了四次，反映了CRISPR-Cas领域的兴奋和竞争。从好的方面来看，这些对相同蛋白质的重复研究一直是一致的，所以我们可以对我们关于Acr机制的结论充满信心。值得注意的是，在16个不同的Acr(图3)的结构中，没有一个与其他任何一个显示出任何相似之处，反映了每个Acr家族独特的进化起源。
图3：目前已有的Acr蛋白结构
尽管存在这种结构多样性，但仍存在一些机制重叠。最常见的是Acr在PAM相互作用区或靠近PAM相互作用区的结合，这是AcrIF2、AcrIF10、AcrIIA2、AcrIIA4和AcrVA1共有的属性。这些Acr都是酸性的，并且在不同程度上模仿DNA。DNA模仿是许多DNA结合蛋白抑制剂的共同主题，包括限制酶的噬菌体编码抑制剂。
Acr的第二个最常见的阻断DNA切割活性，AcrIF3、AcrIE1和AcrIIC1具有这一活性。除AcrIIC2外，没有Acr阻止CRISPR-Cas复合物的生物发生。一般来说，如果Acrs能够直接阻断已经形成的CRISPR-Cas复合物的活性，那么它们似乎具有最大的效用，当外源DNA被导入细胞时，这种复合物通常会存在。最近发现的具有酶活性的Acr是非常令人兴奋的，我们预计会有更多这样的例子出现。
具体每种Acr对不同Cas蛋白的抑制机制的生化和结构细节文中列举的很详细，这里不再详叙。
展望：
从1月的第一篇论文开始，现在(截至8月)PubMed上有99篇论文提到了Acr。值得注意的是，其中63篇已于和发表，强调了人们对这一领域日益增长的兴趣。尽管关于Acr的知识积累迅速，但到目前为止，我们肯定只看到了冰山一角。鉴于Acrs对多种不同的CRISPR-Cas系统的抑制作用已被迅速发现，我们预计在不久的将来会发现更多的Acr家族，并最终发现Acr对每种类型的系统都有抑制作用。随着Acrs的广泛出现，CRISPR-Cas系统是否经常参与噬菌体防御以外的功能，以及Acr是否通过调节CRISPR-Cas的活性而不是完全抑制来参与这些功能的问题将变得至关重要。未来感兴趣的另一个领域将是阐明更多的Acr机制。这些机制已经被证明是非常多样化的，继续关注这一领域将为CRISPR-Cas的功能提供更多新的见解，并可能带来许多惊喜。最后，CRISPR-Cas系统只代表了许多细菌抗噬菌体防御机制中的一个，并且这些系统的已知数量在过去四年中有了很大的增长。虽然由于围绕CRISPR-Cas系统的兴奋，Acrs已经被迅速发现和表征，但这些迷人的新抗噬菌体系统还没有发现抑制剂。应用于Acr系统的发现方法应该适用于寻找新的所谓的anti-anti-phage系统，我们期待着从这些努力中涌现出令人兴奋的新的研究领域。
原文链接：/10.1146/annurev-biochem-011420-111224
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