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文章来源：中华骨科杂志,,40 (09): 607-613
作者：郑海艺 田珂 林涛 王国栋 张元民
摘要在全球范围内，每年有200多万例骨移植手术用于骨科、神经外科和牙科手术中的骨缺损。目前的治疗方案包括使用人、动物或合成来源的移植物。在这种情况下，自体移植是目前的黄金标准。然而它的数量是有限的，需要创建第二个伤口(供体部位)，并且感染、疼痛和发病率的风险也随之提高。近年来，组织工程与3D生物打印的兴起，为治疗患者骨缺损提供一种新思路。3D生物打印是"增材制造"在生物组织工程中应用的分支，能对细胞进行精确控制，并按需实现个性化构建宏观及微观的结构，能在骨再生运用中得到运用。其中成骨细胞支架的建立是3D生物打印的基础，具有适宜骨和软骨生长的水凝胶是支架研究的基础，为此国内外学者进行多种水凝胶支架的开发与研究，发现由多种生物材料混合的水凝胶比单一材料水凝胶更具有优势，如以羟基磷灰石或藻酸盐或透明质酸为主体混合几种或多种生物打印材料，结合所需细胞后最终形成的3D打印骨支架，比传统支架更能够促进骨成长分化。随着打印结构变厚，营养物质和氧气的扩散越来越困难，这在骨组织的重建中尤其如此，需要制造互连且有效的血管网络，因此支架中血管的形成是必不可少的环节。本文主要综述了3D生物打印中骨打印支架材料与血管网络形成的逐步探究进展。
一、文献检索
本文以"水凝胶"和"3D骨打印"为中文关键词，在万方数据知识平台、维普中文生物医学科技期刊数据库、中国知网数据库进行检索，检索结果限于中文文献；并以"3D bioprinting"or"three-dimensional bioprinting"，and"Bone"and"Hydrogel"作为英文关键词，在PubMed、Web of Science数据库进行检索，检索结果限于英文文献。设定文献检索时限为2000年1月至12月。
文献纳入标准：①与骨与软骨3D打印研究进展相关的临床或基础研究；②文献中的研究符合知情同意和临床伦理要求；③文献语种为英文。排除标准：①个案报告；②文献类型为Meta分析；③同一作者团队早期的重复研究；④单纯细胞移植的基础研究。
数据库检索文献210篇，去除重复后得到119篇文献。对文献全文阅读，并根据纳入及排除标准筛选，最终本综述纳入59篇文献，包括57篇英文文献和2篇中文文献（图1）。
图1文献筛选流程图。最终纳入文献59篇，其中57篇英文文献，2篇中文文献
二、3D打印成骨
骨是一个多细胞单元组成，并基于血管、成骨细胞、破骨细胞和神经细胞之间密切合作的动态结构[3]。3D生物打印较非生物打印更为复杂，其涉及生物材料制造、生长因子（growth factor，GF）递送、细胞选择等许多技术的挑战[4,5,6]。因此，整合生物材料科学、细胞生物学、工程学等领域技术至关重要，其中关键的挑战是重建由细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分和多种细胞类型组成的生态位，以概括生物学功能[7]。
人体脂肪组织来源干细胞（human adipose derived stem cells，HASCs）和骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSCs）较容易获得，且能够迅速增殖，可作为组织工程研究的候选者[8]。天然水凝胶具有优异的生物相容性和可生物降解特性，可定制各种形状和尺寸，并且可以提供较为理想的物理和化学特性。由于这些性质，水凝胶可用作细胞友好材料，提供信号以指导细胞分化进程，并以受控方式释放蛋白质或药物[9]。上述原因使得水凝胶支架非常适合运用于组织工程研究，这也是全球研究越来越关注水凝胶制造和优化的原因[10]。用于组织工程的骨支架，必须具有良好的生物相容性或细胞相容性，以便为细胞黏附、增殖、分化和分泌ECM提供表面。为此学者们进行了大量3D生物打印的支架相关研究，制造各种混合材料支架以优化打印效果（图2）。
图23D骨组织打印流程图。目的细胞（骨、软骨等）培养与扩增后与生物材料（羟基磷灰石、藻酸盐等）制备的水凝胶混合，然后通过3D生物打印机打印出所需骨支架，将支架安放组织缺损处达到再生组织目的
适合骨和软骨再生的水凝胶支架是3D骨组织打印的基础，随着最初的单一生物材料水凝胶的应用，再到由多种生物材料混合的水凝胶，发现后者比单一材料水凝胶在细胞成骨分化及血管形成等方面更具有优势，下文总结了以羟基磷灰石或藻酸盐或透明质酸等为主体混合几种或多种生物打印材料的水凝胶的各自优势。（一）羟基磷灰石（1）羟基磷灰石的特性羟基磷灰石是人体骨骼的主要无机成分，具有显着的生物活性和骨传导特性[11]。You等[12]采用羟基磷灰石-海藻酸钠混合物经3D打印具有多孔结构的水凝胶支架，发现软骨细胞可存活和增殖，表达更高水平的钙化软骨标志物，包括X型胶原分泌，碱性磷酸酶活性和矿物质沉积。Kuss等[13]在进行正常或短期低氧环境中调节后，将由羟基磷灰石-聚己内酯和载有血管基质组分细胞群的水凝胶生物墨水组成的3D生物打印的骨骼构造物植入无胸腺小鼠中，发现短期缺氧条件促进体外和体内微血管形成，并促进与现有宿主脉管系统的整合，但不影响成骨分化。（2）纳米羟基磷灰石颗粒当羟基磷灰石尺寸达到纳米级，与传统材料所表现出的生物学和力学特性相比，前者对于细胞共混物3D生物打印体的结构稳定、力学性能及生物性能等均可能产生积极作用。另外，由人体脂肪组织来源干细胞组成的3D生物打印构造物具有促进矿化基质形成的作用，并且其可用于3D生物打印构造物中以修复大的骨组织缺损[14]。Xu等[15]采用直径<200 nm的纳米羟基磷灰石颗粒，以合适的浓度（10 g/L）加入海藻酸钠/明胶水溶胶共混物后进行3D生物打印，发现其细胞共混物可满足3D生物打印过程中对于打印基质材料流动性和塑形性质的要求，对打印后细胞的增殖性以及成骨分化能力都具有优势。Mironov等[16]用纳米羟基磷灰石/胶原蛋白复合材料作为骨组织工程支架，发现其有利于成骨细胞的早期附着，可提高其分化能力。臧晓龙等[17]用纳米羟基磷灰石-聚乳酸羟基乙酸支架与骨形态发生蛋白2复合体共同打印，其孔隙率、孔径、缓释性能、降解速率、机械强度等指标，均符合构建组织工程骨的生物学要求。（3）激光辅助生物打印激光辅助生物打印由于其前所未有的细胞打印分辨率和精度，是一种非常有吸引力的骨替代物原位打印工具。Keriquel等[18]实验研究证实实验室可在小鼠颅骨缺损模型中原位打印与胶原和纳米羟基磷灰石相关的间充质基质细胞（mesenchymal stem cells，MSC）以促进骨再生。此外，通过测试不同的细胞打印几何图形，发现不同的细胞排列对骨组织再生的影响，发现圆盘激光辅助印刷的MSC在体内体外均可存活并增值。这种方法可以促进骨再生，同时不会对邻近的脑组织产生有害的影响。上述相关研究成功获取了具有高细胞活性的含有羟基磷灰石的3D生物打印结构体，证实了将羟基磷灰石加入细胞共混物3D打印基质的可行性，并获得了羟基磷灰石对打印体内细胞增殖情况和成骨分化情况影响的初步结果。（二）藻酸盐（1）藻酸盐-明胶混合物藻酸盐是从海藻中分离出的一种天然多糖，为目前3D生物打印中常用的生物墨水。明胶是胶原部分水解而得到的一类蛋白质，其与胶原具有同源性。任荣等[19]发现明胶∶藻酸盐质量比为15∶2时，因具有均匀孔径，并且能够满足3D打印墨水的性能要求，考虑可作为3D生物打印的墨水。并且将藻酸盐-明胶混合物中的明胶浓度提高至15%可提高MSCs的贴壁率和存活率[20]。Yu等[21]关于藻酸盐-明胶水凝胶支架对人牙髓干细胞影响的研究，发现3D打印的藻酸盐-明胶水凝胶支架促进人牙髓干细胞的成骨/成牙本质分化，并增强骨样结节的形成和碱性磷酸酶染色，矿化相关基因表达亦上调并含有更多的钙和磷离子。Wu等[22]通过向藻酸盐-明胶水凝胶中加入介孔生物活性玻璃，发现藻酸盐-明胶水凝胶中的介孔生物活性玻璃增加了生物印刷的人成骨肉瘤细胞的增殖和矿化作用。（2）加入促血管生长物质的藻酸盐研究表明，与藻酸盐混合并加入促血管生长物质可促进支架的血管生成。Ahlfeld等[23]用磷酸钙水泥糊剂和藻酸盐-结冷胶水凝胶糊剂中掺有血管内皮生成因子制成的支架。发现大鼠间质基质细胞能够在支架上黏附并生长，并向成骨细胞分化。其还观察到持续的血管内皮生成因子释放，可在体外刺激内皮细胞增殖以及血管生成。Cidonio等[24]通过将血浆和藻酸盐-甲基纤维素混合，获得糊状生物墨水，该墨水包含人新鲜冷冻血浆，因此包括供体/患者特异性蛋白质混合物可高精度绘制，并且还可进行生物印迹的人骨髓来源的间充质基质细胞和原骨祖细胞扩散到生物墨水中。将新型的基于血浆的生物墨水与可绘制的自固化磷酸钙相结合，打印出的支架成骨性和血管生成均具有优势。（3）藻酸盐-氧化石墨烯藻酸盐-氧化石墨烯复合材料作为生物墨水可改善成骨组织工程应用的可印刷性、结构稳定性和成骨活性[25]。用人骨髓来源的间充质基质细胞和藻酸盐-氧化石墨烯印刷的3D支架表现出显着增强的成骨分化。另外，Möller等[26]发现基于纳米纤化纤维素与藻酸盐混合的生物墨水为人骨髓来源的间充质基质细胞提供了合适的环境，以在体内3D生物打印的结构中合成新软骨。（4）藻酸盐、甲基丙烯酰胺明胶和β-磷酸三钙颗粒藻酸盐、甲基丙烯酰胺明胶和β-磷酸三钙颗粒的复合生物链可调节人骨髓来源的间充质基质细胞的分化朝向骨软骨组织钙化区的形成。Kosik等[27]用含有β-磷酸三钙的3D仿生水凝胶支架，通过基于挤出生物打印过程实施的同轴针系统来工程化钙化软骨。水凝胶支架在软骨形成培养基中培养长达21 d，通过逆转录PCR定量评估相关软骨形成和成骨基因标记的基因表达证实所提出的方法产生钙化软骨组织的功能性体外模型的潜力。经过全面的生物链优化后，发现磷酸三钙在质量浓度为0.5%时形成稳定支架最佳，具有高形状保真度，并具有与钙化软骨发育相关的生物学特性。（三）透明质酸透明质酸是一种酸性粘多糖，其在水凝胶中是骨晶体沉积的关键因素，亦为骨形成的成核部位[28]。Beşkardeş等[29]发现壳聚糖-透明质酸超多孔水凝胶中有很高的细胞增殖能力，这种支架在骨组织工程中具有很高的生物活性。Lee等[30]研制了生物活性肽与酪胺偶联透明质酸复合生物墨水，可使生物活性多肽和酪胺偶联透明质酸的快速凝胶化。生物墨水在200 s内迅速凝胶化，成纤维细胞在该杂化生物墨水中培养7 d后存活率达90%。Noh等[31]用透明质酸/丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酰基明胶组成的水凝胶作为生物打印的生物墨水，既显示出稳定的流变性，又具有优异的生物相容性，并且凝胶显示出良好的可印刷性。纳米复合水凝胶通过双通道3D生物印刷方法构建：基于聚乙二醇二丙烯酸酯/硅酸镁锂纳米粘土/透明质酸生物油墨。Zhai等[32]以成骨细胞为载体的纳米复合水凝胶构建体，一个通道携带由聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）铺设预水凝胶溶液，使其适当地粘稠以促进3D生物打印过程并且有助于交联后氧气和营养物的递送和细胞生长。另一个通道使用封装于质量浓度为20%的透明质酸溶液中的原代大鼠成骨细胞（primary rat osteoblast，ROB）引导细胞准确递送到3D支架中。透明质酸组分不仅用于保护ROB在交联过程中免受紫外线损伤，而且还保证均匀分布和细胞活力（1 d后>95%）。由PEG-纳米复合交联水凝胶组成的新型生物降解能生物油墨用于促进3D生物打印并且能够有效地将氧和营养物递送至生长细胞。由于生物活性离子（镁离子和硅离子）的释放，载有细胞的PEG不仅可以在短期内包裹成骨细胞，并表现出长效且优异的成骨能力，其在体外和体内诱导合适的微环境以促进负载的外源ROB的分化。这种3D生物打印方法在细胞植入、存活和最终长期功能方面对骨组织再生具有很大希望。甲基丙烯酸化透明质酸凝胶的粘弹性特性的变化直接影响细胞命运[33,34]，当选择合适的水凝胶浓度并具有这种粘弹性时，甲基丙烯酸化透明质酸水凝胶可作为骨再生的合适支架材料[35]。Poldervaart等[36]修改了天然存在的透明质酸，以产生具有增加的机械刚度和长期稳定性的光可交联水凝胶甲基丙烯酸化透明质酸，随后将人骨髓来源的间充质基质细胞掺入甲基丙烯酸化透明质酸凝胶水凝胶中，培养21 d后细胞存活率保持在64.4%，无额外成骨刺激条件下人骨髓来源的间充质基质细胞的成骨分化在具有高浓度（质量浓度为1%~3%）甲基丙烯酸化透明质酸凝胶聚合物的水凝胶中自发发生，向培养基中添加骨形态发生蛋白-2进一步增加成骨分化。甲基丙烯酸化透明质酸凝胶水凝胶被证明适用于3D生物打印，并被印刷成多孔和解剖学形状的支架。
（四）其他生物打印支架材料生物矿物涂层纳米纤维和人脂肪干细胞的复合材料融合制备体外3D矿化组织。Ahmad等[37]通过结合功能化纤维及人脂肪间充质干细胞制造复合球体，这些干细胞被融合形成3D矿化组织构建体。在无成骨补充剂的培养基中体外培养球状体显示成骨基因的表达显着增强，复合球体保持细胞活力，并在结构中显示出普遍分布的矿物质。复合球体可用作体外骨骼模型，体内细胞载体的开发的替代平台，以及用于生物打印3D骨组织的构建块。胶原微纤维结合骨形态发生蛋白2与胶原结合域作为分化控制模块，前者能够可控地释放。Du等[38]通过在三种微环境中比较BMSC在印刷支架中的分化行为：在生长培养基中无分化控制模块样品，分别在成骨培养基中无微纤维的样品和在生长培养基中含微纤维的样品。结果发现BMSC在印刷过程中表现出较高的细胞活力（> 90%）;该分化模块在14 d内诱导BMSC向骨细胞分化，比成骨培养基有效。上述研究表明，这些功能控制模块是具有吸引力的生物材料，并且在3D生物打印中具有潜在的应用。通过无溶剂工艺以制造聚多巴胺修饰的硅酸钙-聚己内酯支架以及沃顿氏胶质间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞-负载水凝胶。合成材料与细胞成分的混合体不仅增强了成骨作用，而且还可刺激血管网络发展，这表明3D打印可以在许多方面进一步应用于改善骨组织再生的事实[39]。
三、血管网络的形成
骨的宏观结构从外周的皮质骨（密质骨）到中心的松质骨（骨小梁）并非一致[40]。虽然皮质层和松质层之间存在一些差异，但其均包含高度血管化的网络。其中最主要的原因是受损骨骼的功能强大的区域，即所谓的"关键缺陷"，需要一个相互联系的有效血管网络[41,42]。尽管目前组织工程学取得了重大进展，但由于缺乏适当的血管化构建，大组织的重建仍然受到限制[41,43]。随着结构变厚，营养物质和氧气的扩散越来越困难，这在骨组织的重建中尤其如此。此外，微血管系统和微循环的发展是手术后骨再生的关键步骤[44]。没有微血管形成的大型移植物的植入已被证明是不充分的灌注，并导致移植物失败。体外细胞模型的发展，结合祖细胞和生物材料，可克服这一限制并促进骨再生[45]。
为使临床使用3D生物打印组织变为现实，需要制造互连且有效的血管网络，解决这一挑战至关重要。Sun等[46]成功在负载生长因子的可生物降解的纳米多孔磷酸钙支架内模拟了血管化骨生成。Midha等[47]采用生物活性纳米复合玻璃泡沫支架体外培养了成骨细胞和血管细胞。Cidonio等[48]创建了一种由皂石与明胶甲基丙烯酰基复合材料组成的用于骨骼再生治疗的新型多功能（成骨和血管生成）纳米复合生物墨水。上述实例均显示纳米结构材料如何用于有效地诱导血管化骨生长。Temple等[49]设计并生产了具有人体脂肪来源的解剖学形状的血管化骨移植物细胞和3D打印的聚己内酯支架。Holmes等[50]成功地设计并印刷了一系列新型3D骨骼支架，其具有骨形成支撑结构和高度互连的3D微血管模拟通道，用于有效和增强的成骨再生以及血管细胞生长。将样品与纳米羟基磷灰石结合，创建用于血管化骨生长的新型微米和纳米特征装置。基因表达结果发现BMP-7D诱导最高的成骨分化，以及干细胞的血管分化。BMP-7D是骨形态发生蛋白家族的一员，依赖于Smad的BMP信号与受体（RI，RII）结合，然后信号被转导到Smad。激活的Smad调节骨形成转录因子（runx2）的表达，促进成骨基因如碱性磷酸酶，通过对其活性评估发现，BMP-7肽转导的肌源性祖细胞分化为成骨细胞，BMP-7增加了血管生成过程中血管生长内皮因子的表达[51,52,53]。
在体内通过强调组织工程骨构建物与宿主血管供应相关的灌注微血管的存在，证明了促进骨构建物中血管化的合作。基于共培养的涉及血管内皮细胞和成骨细胞的预血管形成已显示出可以刺激预先形成的血管和宿主血管之间的吻合，并促进宿主毛细血管向植入结构中的生长[54]。此外，内皮细胞和成骨细胞共培养可促进替代物的血管化和骨整合[55]。与间充质细胞共培养以使内皮细胞停留在印刷区域并最终形成毛细血管，人骨髓来源的间充质基质细胞对毛细血管的稳定作用可解释该作用[56]。
每种3D打印支架均有其优缺点，3D打印方法、打印组织部位和混合材料的比例均为打印结果的影响因素。目前绝大多数实验均建立在细胞或动物水平上，3D生物打印的细胞是否能够在人体内植入后实现骨组织的功能特征仍然未知。既往大多数报道的用于骨再生的载有细胞的支架的长期体内评估是有限的，在细胞水凝胶结构中不存在大孔空隙，呈现出营养扩散限制[57]。虽然骨骼组织工程迅速发展，软骨更具挑战性，因为软骨无血管的特性限制了其在组织内循环营养的能力[58]，尤其骨软骨更要面临组织特异性细胞外基质的多样性成分和机械性能的挑战。理想的生物墨水填充剂是将提供增强的可印刷性，并同时赋予细胞指导性的骨形成和血管生长特性，但是随着前人的探索，生物打印细胞已被用于修复绵羊颅骨缺损和小鼠颅骨缺损模型[18,59]。未来3D打印技术甚至依赖于新的生物材料对刺激（湿度、温度或化学物质）做出反应的4D打印会取得进一步的发展。
参考文献（略）
