1 电场参数
电场是电转染的重要因素,细胞在电场的作用下,膜通透性增加或是形成小孔,以完成转染过程。因此电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此,一个适宜的电场强度至关重要。
不同细胞系具有不同的最佳场强值,其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外,还可以采取较为简便的间接法。文献显示存活率在50%左右的电场参数为理想参数,故可间接测定存活率来确定最佳场强值。
2细胞因素
用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2d)。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛,表面结构致密比稳定期的细胞差,电转后,细胞膜的恢复能力强,而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA.细胞悬液浓度一般为1*106/ml,当细胞生长密度大于3*106/ml,转染效率会下降。原因除了细胞老化外,细胞过密会使相邻细胞相互作用增大,甚至使细胞相互融合,从而导致电场的局部微扰,使电场环境无法均一化,细胞体积越大对电击越敏感,所需电场强度也越小。
3 质粒因素
从质粒浓度看,细胞密度为1*106/ml,DNA用量在2-5ug/ml转染效率最高。转染率在一定一定范围内随质粒浓度的上升呈线性增高,但是到达一个峰值后,随DNA用量增加而转染率逐渐下降,其原因可能为细胞吸纳DNA有一个饱和度,过量便会产生毒性,使存活率降低,不利于转染率提高。
进行小分子量的分子转染时(siRNA/miRNA),应使用高电压、短脉冲时间。大分子量分子转染时(DNA),应使用低电压,长脉冲时间。
从质粒的纯度看,用高纯度的DNA才 能提高电转的效率,且应注意以下几点:首先DNA/RNA应该超纯(A260/A280>1.8),其次应不含内毒 素,同时质粒应溶于双蒸水而不是TE缓冲溶液。
4 温度
一般情况下,电转的过程是在室温下进行,但在 电击前后可对细胞进行冰浴处理。电击前冰浴的时间对转染率影响不大,但低温环境能够防止DNA被外源性DNA酶降解,并限制在电击中因Joule作用而产生的不良反应,因此,实验一般选择电击前冰浴5min。电击后冰浴,会影响DNA摄入,因为电击后冰浴可增强细胞收缩,细胞膜上的 电穿孔封闭较慢,延长外源性DNA摄入时间,从而提高其摄入量。在室温环境下,虽然细胞膜上的孔 封闭速度快,但在随后2h,质粒还可通过电内化进入细胞,因此摄人量不一定比4℃环境下低。而且,室温下细胞在5 min内即闭孔,在4℃的环境下穿孔状态可保持4h,穿孔封闭缓慢降低了存活率,同时细胞在低温下更容易受到损伤。
因此,综合考虑摄人量和存活率,大部分文献倾向于电击后细胞仍在室温或37℃下保存。
5电转染试剂的选择
电击会对细胞造成一定程度的伤害,在转染试剂的选择上要注意,应选择具有细胞膜修复成分的电转染试剂,如engreen的Entranster-E,将电击对细胞的损伤降到最低。
6电转后培养液的选择
细胞在电击后十分脆弱,其 培养液的选择应注重提高细胞的存活率,一般选择 低渗的RPMI 1640+10%FCS。除此之外,可参考 加入50 mmol/L海藻糖+1.25%DMSO,因为海藻 糖具有稳定DNA、蛋白质以及细胞膜的作用,并提高电转后细胞特别是淋巴细胞的存活率。此外, 有文献显示凋亡是细胞电击后死亡的主要原因,电 击后的培养液还可加入Caspase抑制剂和SCFGM-CSF等细胞因子。