通过宏基因组分析揭示与便秘相关的肠道微生物的组成和代谢功能
Unveiling the gut microbiota composition and functionality associated with constipation through metagenomic analyses
期刊名称：scientific reports
时间：8月29日 IF: 4.122
摘要
功能性便秘（Functional constipation，FC），是一种较普遍的胃肠道疾病，它的确切病因仍未知，但越来越多的证据表明，肠道菌群的改变会引起便秘。然而，文献存在矛盾并且没有明显把FC和肠道菌群组成联系在一起。本文对包括58个FC患者和79个健康人（HS）总共147份粪便样品进行16S肠道菌群分析，从中发现FC的Bacteroides、Roseburia和Coprococcus3丰度降低了；再对5个FC和5个HS样品进行宏基因组分析，比较两组的肠道菌群代谢能力，发现HS在涉及碳水化合物、脂肪酸和脂质的代谢通路上富集，而FC有关产氢、产甲烷和甘油降解的基因丰度更高。这些差异菌群和代谢能力或许在功能性便秘发展过程中起到重要的作用。
研究背景
人类胃肠道定植着复杂的微生物群落，它们牵涉到宿主的多项生理功能，对维持宿主的健康至关重要。因此，肠道微生物组成的改变也与某些常见的人类肠道疾病有关，比如伪膜性结肠炎（CDI），溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）等。FC也是一种流行性的胃肠道疾病，在人群中的发病率在5%到20%之间，它会引起腹痛、腹胀、头痛和食欲不振等，严重影响患者的生活质量。虽然FC很普遍，但是只有少数研究将它与肠道微生物联系起来，此外，这些研究中的大部分是基于培养微生物的方法，无法评估肠道菌群中不可培养的部分，而肠道菌群变化引起的潜在功能变化对人体的影响也没有研究过。其他涉及到肠道菌群与便秘关系的研究，也受到样品数量和样品异质性（样品中包括不同性别、肥胖儿童等）的限制。
为了得到具有统计学意义和全面的肠道微生物-便秘关系，本研究收集了68份FC和79份HS粪便样品，对这147份样品进行了16S分析，而为了更好理解肠道微生物的作用及其代谢对人体带来的影响，本研究又从这些样品中分别挑选出5份FC和HS进行宏基因组分析。
研究方法
本研究从意大利人中招募68个FC患者和44个HS，再加上之前发表的35份HS样品总共147份样品，其中FC患者排便频率低且满足罗马III标准。新收集的112份样品采用与之前研究的35份样品一样的处理方法。147份样品选择了V3区进行16S测序，采用了IlluminaMiSeq测序仪，分析软件使用QIIME，参考数据库选择了SILVAv.123版本。5份FC和5份HS样品采用Illumina NextSeq进行2X150bp测序，细菌代谢通路的分析采用了基于htseq-count和MetaCyc数据库编写的自定义脚本。
研究结果
FC和HS组间、组内的差异
平均稀疏曲线显示FC和HS之间具有差异，FC具有更高的肠道菌群复杂性，ANOVA分析表明这样的差异具有显著性（p<0.05），这与别的研究结果相似，说明FC和HS之间在菌群组成上不同，相应的潜在的代谢也不同。为了评估FC和HS个体间的差异，本研究采用未加权UniFrac方法分析了β多样性，结果用三维PcoA图进行展示。PCoA图显示大部分样品分成了两类，分别对应于FC和HS，这突出体现了FC和HS个体之间肠道菌群组成的不同。
图1. 147个样品的α和β多样评估。a为随着测序深度的增加，基于Chao1和香农指数的平均稀释曲线；b为三维和二维PCoA图。
肠道菌群组成的不同
为了评估肠道菌群组成的不同，本研究对FC和HS平均相对误差>0.1%的属的相对丰度进行了ANOVA分析，比较结果表明，HS的Bacteroides、Roseburia和Coprococcus 3相对丰度更高（p<0.01），而Ruminococcaceae科比如Faecalibacterium的相对丰度更低（p<0.01）。FC中Bacteroides属的降低可能与肠道动力的改变和分泌功能有关。HS样品中更高丰度的产丁酸微生物，比如Coprococcus和Roseburia，可以解释HS的肠道运动更快，因为肠道中的丁酸具有促进肠道运动的作用。之前的研究也表明微生物产生的丁酸可以通过血清素释放诱导或促进类胆碱通路来刺激肠道运动。然而，同样为产丁酸的Faecalibacterium却在FC患者中丰度更高，该菌被报告与通过多种机制促进便秘发病，比如通过抑制粘蛋白分泌和减低粪便体积等。
图2.FC和HS的差异物种。
FC和HS微生物的宏基因组特征
从PCoA图中分别选择5份具有代表性的FC和HS样品，进行宏基因组测序。代谢通路分析结果显示，FC和HS在629个通路上具有显著差异，其中327个在FC中丰度更高，302个在HS中丰度更高。HS样品中涉及碳水化合物和脂肪代谢的基因丰度比FC样品高，这些通路与短链脂肪酸链（SCFAs）的产生有关，它们在通过肠胆碱能反射刺激回肠收缩上具有重要作用。而FC样品含有更高丰度的与产甲烷通路有关的基因，且具有更高的产氢能力。本研究的结果与前人的研究结果一致，暗示产甲烷和产氢气微生物的存在影响结肠运动和结肠敏感性，并产生了慢性便秘和其他一系列症状，如肠胃胀气和腹胀等。与HS相比，FC样品还具有更低丰度的丙酮醛降解基因，丙酮醛由肠道细菌产生，是一种与多种肠道疾病有关的潜在有毒代谢物，包括FC。FC和HS之间具有显著性差异的通路还包括甘油降解，甘油在直肠具有渗透作用，因此被用来治疗便秘，FC样本表现出更高的甘油降解能力可能导致和促进便秘的症状。不过，尽管排除了在取样前一周有使用过泻药的样品，这个结论也有可能与之前或者长期使用PEG或甘油栓有关。
图3. FC和HS微生物的功能特征。
本研究也分析了FC和HS在属水平和差异代谢通路之间的协方差。网络图显示Bacteroides，Ruminococcaceae科的属和产甲烷的属Gelria，在调节肠道菌群功能中发挥着重要作用，而这些细菌在FC中发生了变化。此外网络图也显示厚壁菌门与设计产氢和产甲烷有关的通路有正相关，而Bacteroides与丙酮醛降解通路呈正相关，这些结果表明，Bacteroides在缓解FC上具有潜在的有益作用。
图4. 具有显著关系的菌群和代谢通路协方差网络。a为菌种-代谢通路具有显著关系的协方差网络图，b为与FC发生有关的菌群-代谢通路协方差网络。
研究结论
本研究通过FC和HS样品的对比，证实了FC影响了肠道微生物组成变化，引起了肠道微生物多样性的显著提高，统计分析显示在一些物种的丰度发生了显著改变，如Bacteroides和Feacalibacterium，这些细菌可作为具有统计学支持的便秘微生物标记物，将来可以用来诊断和预防便秘。而被公认与健康人肠道菌群有关的细菌，如抗炎的Feacalibacterium，却可作为FC的一种生物标记物，说明在有肠道疾病的情况下，某些种群丰度的提高，可能不能反映出这些物种在发病机制中的特异性作用，但可能与肠道菌群内稳态的整体改变有关。
肠道菌群代谢潜能及其对功能性便秘宿主生理和发育的影响尚待阐明，而为了弥补这方面的缺失，本研究通过宏基因组测序方法，对比了FC和HS之间的微生物代谢通路，首次发现了FC菌群中与产氢、产甲烷、降解甘油相关的基因丰度升高了，而HS则在碳水化合物、脂肪酸代谢、丙酮醛降解通路上的基因丰度增加。这些代谢通路的改变影响了FC及相关症状，凸显了肠道微生物在FC中起到重要作用。
DOI：10.1038/s41598-017-10663-w
文案：生信部 张煌凯
编辑：医学市场部 潘旭兰
通过宏基因组分析揭示与便秘相关的肠道微生物的组成和代谢功能【便秘与肠道菌群（二）】
