新型冠状病毒核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒
【生产厂家】上海科华生物工程股份有限公司
【批准文号】国药试字S0001
【剂 型】检测试剂盒
【规 格】32人份
【医保类型】
【国家基本药物】否
【试剂盒名称】
新型冠状病毒核酸扩增(PCR)-荧光检测试剂盒
【英文或拉丁名】
Novel Coronavirus PCR Fluorescence Diagnostic Kit
【汉语拼音】Xinxing Guanzhuang Bingdu Hesuan Kuozeng (PCR) Yingguang Jiance Shijihe
【使用目的】
用于血清、血浆标本中新型冠状病毒核酸RNA的定性检测，可试用于新型冠状病毒感染的辅助诊断。本品检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据，对实验结果的解释，详见【实验结果的解释】及【本检测方法的局限性】。
【前言】
本品选取新型冠状病毒的pol基因的一个保守区为靶区域，扩增片段长度为78bp，设计特异性引物及荧光探针，采用柱抽提法提取RNA，利用RT-PCR一步法进行核酸扩增，利用全自动荧光PCR检测仪在线检测荧光信号。适用于临床血清、血浆标本中新型冠状病毒核酸RNA的定性检测。
【试剂盒组成】
本试剂盒由二部分组成：
1.病毒RNA快速提取试剂盒
用于简便、快速地从血清血浆类标本中提取到高纯度的SARSCoronavirusRNA，作为PCR扩增检测的模板。
［裂解液］4ml×1瓶含有硫氰酸胍的溶液
［助沉剂］1瓶含有助沉剂的冻干粉末
［去抑制剂］1瓶含有去抑制剂的冻干粉末
［洗涤液A］14ml×1瓶含有硫氰酸胍的溶液
［洗涤液B］4.0ml×1瓶含有Tris的溶液
［洗脱液］1.8ml×2支含0.04%NaN3的灭菌纯化水（无RNA酶）
［核酸提取柱］32支×1包含连接套管
2.非典型性肺炎（SARS）病原体核酸扩增（PCR）-荧光检测试剂盒
用于检测临床标本中的SARS病毒，并参考定量。RT-PCR试剂
［PCR主反应液］250μl×1支含有一对引物和dNTP的溶液
［酶混合物］90μl×1支含有Taq酶、逆转录酶、和RNA酶抑制剂的溶液
［荧光探针］20μl×1支含有荧光探针的溶液
对照品
[阴性对照] 120μl×1支 含有0.05%NaN3，新型冠状病毒核酸阴性的混合人血清
[弱阳性对照]120μl×1支 含有约100copies/ml体外转录的新型冠状病毒RNA片段
[强阳性对照]120μl×1支 含有约10000copies/ml体外转录的新型冠状病毒RNA片段
【自备的试剂和器材】
自备试剂：无水乙醇（分析纯）30ml
自备实验器材：0.5ml、2ml离心管，经高压灭菌（121℃，30分钟）处理，确保无RNA酶。
各种规格的带滤芯吸嘴（50、200、1000μl），经高压灭菌（121℃，30分钟）处理，确保无RNA酶。
各种规格的加样器
高速离心机
震荡仪
恒温加热仪（水浴或干热）
负压装置
荧光PCR仪：Roche LightCycler
【样本采集】
样本种类：血清血浆类标本
血清：以立即采集分离为好，采血6小时内必须分离、收集血清，并将血清转移至一次性使用的无RNA酶的无菌微量离心管中。
血浆：采用3%枸橼酸钠抗凝，抗凝剂：血液为1：9。
样品如不及时检测，应于-20℃至-80℃冻存。标本运输应于冷冻条件下进行。有关样本能够稳定存放的时间目前不详，建议采样后立即检测。
【适用对象】
荧光PCR仪：Roche LightCycler等
【用法与用量】
标本处理 (所有操作需采用无RNA酶的带滤芯吸嘴及离心管，在标本处理区进行。标本处理区应符合疾病预防控制中心的有关要求！ 所有待检测样本均应严格按卫生部关于"传染性非典型肺炎研究实验室生物安全要求"进行操作和处理。所有操作需采用无RNA酶的带滤芯吸嘴及离心管，在标本处理区进行。)
1.实验前准备
1.1将裂解液置70℃加热5分钟，使试剂瓶内的结晶全部溶解。吸取1ml裂解液加到助沉剂的试剂瓶中，用吸嘴搅动，混匀后全部吸回到裂解液瓶中，混匀后备用。
1.2在去抑制剂的试剂瓶中加入700μl洗脱液，用吸嘴搅动，溶解后混匀备用。
1.3在洗涤液A的瓶子中加入6ml无水乙醇，颠倒混匀后备用。
1.4在洗涤液B的瓶子中加入16ml无水乙醇，颠倒混匀后备用。
2.病毒RNA提取
2.1取N个0.5ml/1.5ml离心管（N=标本数量+3个对照品），作好标记后分别加入20μl去抑制剂。
2.2分别用带滤芯吸嘴加入100μl需检测的标本和对照品，用带滤芯吸嘴反复吹打5次。
2.3再分别用带滤芯吸嘴加入100μl已混有助沉剂的裂解液,盖上管盖，振荡混匀，离心数秒，置70℃反应10分钟。
2.4离心数秒,用带滤芯吸嘴加入110μl无水乙醇，振荡混匀，离心数秒。
2.5将作好标记的核酸提取柱插入连接管后，固定在负压装置上，将步骤2.4中的所有液体小心移入核
酸提取柱。注意不要将液体溅入其它样品的核酸提取柱内。
2.6开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。
2.7在每个核酸提取柱内加入500μl洗涤液A，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。
2.8在每个核酸提取柱内加入500μl洗涤液B，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。
2.9从连接套管上取下核酸提取柱，将其放入2ml离心管中，盖上管盖，14000rpm离心1分钟。
2.10将提取柱放入一新的2ml离心管中，小心将50μl洗脱液加在柱面中央，静置1分钟。
2.11 10000rpm离心1分钟，取2ml离心管中的收集液10μl做PCR反应模板。
RT-PCR试剂准备（在PCR前准备区进行）
从试剂盒中取出PCR主反应液、酶混合物和荧光探针,室温下融化后离心数秒,按照待扩增标本数量x，取PCR主反应液（1+x）×7μl，酶混合物（1+x）×2.5μl，荧光探针（1+x）×0.5μl混合，充分混匀后离心数秒，分装至PCR毛细反应管中，每管10μl，将装有PCR反应液的毛细反应管转移至标本处理区。
RT-PCR扩增反应液配制表
扩增样品数 PCR主反应液 酶混合物 荧光探针 合计
1077μl 27.5μl5.5μl110μl
4μl 55μl 11μl220μl
32 245μl87.5μl17.5μl 350μl
加样（在标本处理区进行）
1.在装有PCR反应液的毛细反应管中用带滤芯吸嘴分别加入10μl已处理好的标本（标本处理步骤2.11离心管中的洗脱液）。
2.盖上管盖，离心数秒后转移到扩增检测区。
PCR扩增检测（在扩增检测区进行）
1.将毛细管放入LightCycler扩增仪进行扩增检测。
2.循环参数设定:
3.荧光检测通道:F1。
【结果获取】
1. 选F1或F1/F2通道，点击Quantification按纽，进入数据分析界面。
2. 在数据分析窗口中，将噪音线Noise Band的位置移至刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点，且CT值不出现任何数值为准（可根据仪器本身的实际情况加以调整）。，得到各标本的SARS病毒RNA检测结果。
【质控标准】
1.阴性对照的测定结果不显示任何值
2.弱阳性对照的测定结果Ct≤31。
3.强阳性对照的测定结果Ct≤25。
否则本次实验无效，全部实验应重新进行。
【结果判定】
1. 测定结果Ct值≥42的标本为SARS RNA新型冠状病毒RNA阴性标本，表示为"-"。
2. 测定结果Ct值＜42的标本为SARS RNA新型冠状病毒RNA阳性标本，表示为"+"。
【试验结果的解释】
1.至少符合下列情况之一才能报告该病例样本PCR新型冠状病毒检测结果阳性
1.1至少2个不同类型的临床标本（例如血浆样本、粪便样本等）检测结果均为阳性；
1.2从发病第2天起不同时间收集的相同类型的临床样本连续2次以上检测结果均为阳性；
1.3使用2种不同的检测方法或试剂（基于其他反应原理或其他企业产品）对同一临床样本重复检测结果均为阳性。
对于检测结果阳性的报告，只表明该样本中有新型冠状病毒的遗传物质RNA存在，并不表明有活病毒存在，或病毒量足以感染其他人。
2.现有的PCR检测方法虽然特异性较高，但灵敏度仍有欠缺，因此测定结果为阴性并不能排除样本中含有病毒。
3.根据临床考核结果，本品的测定结果会因采样时间的不同而异，因此要将测定结果密切结合临床指征和其他测定结果进行综合分析（详见【临床考核情况】）。
【本检测方法的局限性】
1．本品扩增引物和荧光探针是根据新型冠状病毒AY274119 pol 区加以选择、设计的，其灵敏度和特异性尚有待进一步研究、确证。
2．本检测系统的交叉反应性还没有完全确定，特别是对冠状病毒的种属交叉反应性未进行临床考核，阳性结果不能排除扩增的是冠状病毒属的其它种病毒。
3．目前对于各发病阶段，病毒在人体各组织部位的分布及持续时间等方面的基础研究工作有限。
4．根据本品对临床诊断为确认SARS的患者连续监测的结果：只在在病程的早期，本品才有相对较高的阳性检出率，而在发病晚期，本品检测结果多数为阴性。
5．对于PCR检测阴性的样本，不能排除样本中新型冠状病毒的存在。以下原因可导致阴性结果：
5.1患者并未感染新型冠状病毒，而是由其他感染性原体（如病毒、细菌、真菌等）引起发病。
5.2由于检测灵敏度低，造成假阴性结果。
5.3由于病毒或病毒核酸可能只在一个较短的时间内存在（样本不同，病毒存在的时间有差别），样本并未在病毒或其核酸存在时被采集。本品对临床确诊SARE患者连续监测的结果的显示：只有在病程的早期，本品才有相对较高的阳性检出率，而在发病的晚斯期，本品检测结果多数为阴性。
鉴于上述原因，本品仅试适用于新型冠状病毒感染的辅助诊断，检测结果仅供参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据，最终确诊应密切结合临床指征及其他实验室检测结果综合考虑。
【临床考核情况】
本临床考核是按照国家食品药品监督管理局发布的《SARS诊断试剂生产研制技术要求》进行的。鉴于SARS的特殊性，本临床考核试验尚不完善。有关临床考核情况罗列如下，便于使用者获取更多的信息。
1.考核单位：上海市传染病医院、上海预防医学研究院、北京市地坛医院和上海市血液中心。
2.考核结果：
（1）30天内所有考核样本结果总结（按临床症状起始日至检测时间分段）：
样本情况 标本数 阳性数 检出率
临床确诊SARS患者（发病10天内） 209125 59.8%
临床确诊SARS患者（发病11－20天内） 314 12.9%
临床确诊SARS患者（发病20天以上）3 0 0%
临床确诊SARS病人（全部） 243129 53.1%
非SARS病人 4870 0%
（2）对35例临床确诊SAR
