本发明涉及氨基酸合成技术领域，尤其涉及一种11c-α-甲基-l-色氨酸的制备方法和制备系统。
背景技术：
碳11标记的α-甲基-l-色氨酸是正电子显影成像技术(pet)追踪物。其被广泛的应用于大脑的血清素异常中。这些amt的pet脑显像图的相关研究表明amt高吸收和自闭症的大脑血清素异常，偏头痛和各种精神疾病具有相关关系。碳11标记的α-甲基-l-色氨酸也是唯一有效的脑部癫痫区域标记方法。近年来，由于其能够追踪与肿瘤免疫机制相关的犬尿氨酸循环(kynureninepathway)，amt的pet成像图引起了越来越多癌症研究人员的关注。
越来越多的临床实验证实，在脑部、肺部、胸部的癌症(如juhaszetal.,jcerebbloodflowmet()26:345-357，juhaszetal.,nuclearmed&biol()39:926-932以及juhaszetal.,socnuclearmed()50:356-363)会出现对于amt的高摄取。
获得这些临床应用前景的amt的pet成像图需要使用到高剂量并且可靠的碳11标记的α-甲基-l-色氨酸试剂。不幸的是，碳11标记的α-甲基-l-色氨酸试剂的供应是非常有限的，只能在小规模的实验室设备中，通过人工实验的方法获得极少量的供应。而且，这种标记物的半衰期只有20min，必须在提供碳11的回旋加速器内被快速合成。
因此，现有技术还有待发展，迫切需要一种新型的，能够快速可靠的制备合成碳11标记的α-甲基-l-色氨酸的方法和系统。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种11c-α-甲基-l-色氨酸的制备方法和制备系统，旨在解决现有技术中11c-α-甲基-l-色氨酸的来源受限的问题。
为了达到上述目的，本发明实施例一种11c-α-甲基-l-色氨酸的制备方法。所述方法包括：
将色氨酸前体与碳11标记的ch3i合成获得中间产物；
对所述中间产物加入tfa和氢氧化钾溶液进行水解反应，获得反应粗产物；
通过高效液相色谱，从所述反应粗产物中提纯获得所述11c-α-甲基-l-色氨酸。
所述的方法，其中，所述ch3i通过如下方法制备获得：
制备碳11标记的co2；
以所述碳11标记的co2为原料，使用湿法制备法或者干法制备法制备获得所述ch3i。
所述的方法，其中，在零下40摄氏度的环境下，所述色氨酸前体进行二异丙基氨基锂的去质子化反应以进行甲基化。
所述的方法，其中，所述色氨酸前体为(2(s),3a,(r),8a(s)-(+)-六氢-8-(苯磺酰)吡咯[2,3-b]吲哚-1,2-二甲酸。
所述的方法，其中，所述中间产物为甲基化化合物，所述甲基化化合物如下的化学式所示：
所述的方法，其中，所述对所述中间产物加入tfa和氢氧化钾溶液进行水解反应，获得反应粗产物，具体包括：
加入所述tfa并加热到135℃中维持3min；
在冷却以后，通入惰性气流去除中间产物内的tfa和thf直至所述中间产物完全干燥；
向干燥后的中间产物加入氢氧化钾溶液，密封后加热到150℃，保持5min。
本发明实施例还提供一种11c-α-甲基-l-色氨酸的制备系统。所述制备系统包括：
ch3i制备模块，用于合成制备碳11标记的ch3i；
11c-α-甲基-l-色氨酸制备模块，用于以色氨酸前体和所述碳11标记的ch3i为基础，制备所述11c-α-甲基-l-色氨酸；
所述ch3i制备模块与所述11c-α-甲基-l-色氨酸制备模块通过管道连接件连接。
所述的制备系统，其中，所述ch3i制备模块为模块化气相制备系统，用于以碳11标记的co2为原料，制备获得碳11标记的ch3i。
所述的制备系统，其中，所述11c-α-甲基-l-色氨酸制备模块包括：高效液相色谱模块，所述高效液相色谱模块用于纯化获得所述11c-α-甲基-l-色氨酸；
所述的制备系统，其中，所述系统中通入氩气流令溶剂蒸发，并通过施加具有预定压力的氩气驱动液体传输。
本发明实施例提供的制备方法和制备系统，以amt前体和碳11标记的ch3i为原料，可以自动化并且可靠的生产制备11c-α-甲基-l-色氨酸供使用。整个方法制备获得的11c-α-甲基-l-色氨酸符合使用标准，系统的自动化程度高，有利于在科研和临床医疗研究中使用。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制
图1为本发明实施例提供的11c-α-甲基-l-色氨酸的制备系统的控制面板示意图。
图2为本发明实施例提供的11c-α-甲基-l-色氨酸制备方法的合成原理图。
图3为本发明实施例提供的11c-α-甲基-l-色氨酸的制备方法的方法流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例中揭露的数值及其数值范围是近似值，而并非确定值。在误差或者实验条件允许的情况下，可以包括在误差范围内的所有值。本发明实施例中提供的数值范围用于表示在混合物中的组分的相对量以及其他方法实施例中列举的温度或者其他参数的范围。为陈述简便，以下以[11c]表示碳11同位素标记，amt表示α-甲基-l-色氨酸。
图2为本发明实施例提供的11c-α-甲基-l-色氨酸制备方法的合成原理图。如图2所示，该人工合成方法为两步法，通过amt前体和[11c]ch3i为原料，合成获得最终的目标产物。
其中，amt前体(1)溶解于无水四氢呋喃(thf)中，形成amt前体溶液并在-10℃下，加入二异丙基氨基锂(lda)。
然后，将产生的烯醇盐溶液冷冻至-40℃，引入[11c]ch3i进行甲基化反应，获得中间产物(2)。
在获得中间产物(2)以后，加入三氟乙酸(tfa)和氢氧化钾溶液(koh)水解中间产物(2)以合成获得最终的目标产物(3)。
其中，加入三氟乙酸(tfa)后，加热到135℃中维持3min。加入氢氧化钾溶液(koh)后，加热到150℃中维持5min。
图3为本发明实施例提供的11c-α-甲基-l-色氨酸的制备方法的方法流程图。如图3所示，所述制备方法包括如下步骤：
s210：将4.2mg，10μmol的amt前体溶解于0.5ml无水四氢呋喃(thf)中。所述amt前体为(2(s),3a,(r),8a(s)-(+)-六氢-8-(苯磺酰)吡咯[2,3-b]吲哚-1,2-二甲酸。
s220：在-10℃下，向该amt前体溶液加入15μl,1.5m,2.25μmol的二异丙基氨基锂(lda)。
s230：在氩气保护下搅拌2min后，将产生的烯醇盐溶液冷冻至-40℃。
由于lda的去质子化反应是一个对空气和湿度敏感的反应。因此，在装有amt前体的反应容器在加入无水四氢呋喃之前，保持真空并使用氩气循环清洁三次。并且，在氩气氛的保护下，使用烘干后的玻璃注射器(100μl)将15μllda注入到反应容器中。
虽然，保持amt前体阴离子的理想温度是低于-55℃或者更低的-78℃。但是，在amt前体在-40℃下保持较短时间(小于30min)的情况下，仍然可以获得较好的[11c]amt产率。以上这些措施，都能够避免lda过早的分解，发生去质子化反应从而产生阴离子。
较佳的是，可以采用新鲜制备的thf和lda来尽可能的降低thf和lda的含水量。但是，从正丁基锂中制备新鲜的thf和lda需要耗费较多的时间。因此，在经过前期的合成验证实验以后，也可以采用市面销售的无水thf(acros,ac448136)和lda(acros,ac43287)来制备[11c]amt。
与已有报道的制备方法相比，由于lda和thf的新鲜程度较低，本发明实施例中使用了更多的lda(2.25eq)。在本发明实施例提供的合适处理方式(烘干的注射器)和存储条件(冷藏和封口膜密封)下，可以使用5倍的无水thf和10倍的lda。
在反应混合物发生颜色变化(变为橙色)以后，表明前体阴离子出现，开始进行回旋轰击(s310)。通过气体n2(包含1％o2)向原子核14n[p,α]11c轰击的方式获得[11c]co2(60μa,15min)。
在轰击以后，在氦气流的带动下，[11c]co2流入模块化实验室的gps系统。通常，gps需要使用12min来完成由[11c]co2生成[11c]ch3i的三步反应(s320)。
通过氦气流，在大约3min的时间内，将[11c]ch3i被泵入在先产生的烯醇盐溶液中(s330)。在观察到[11c]ch3br阱的放射性下降时，开启输送开关。过早的开启输送开关会带入未知的杂质气体，从而降低最终产物的产率。
s240：在反应容器中的[11c]ch3i达到最大累积量时，停止供应并在-40℃到30℃逐渐升温的过程中，进行甲基化反应(1min)。
由于一步合成法需要较高的温度(200℃)，而反应容器通常的耐温极限在150℃。因此，在本实施例中使用两步合成法。
s250：将300μl的三氟乙酸(tfa)加入到反应物用于水解，并且将密封的反应容器加热到135℃中维持3min。在冷却1min以后，在150℃下，通入氮气流以去除tfa和thf，直至混合反应物完全干燥(可通过摄像机确认)。
热的tfa在135℃下会在管子上凝结并且在压力传感器与反应器连接。因此，氩气流(大于0.4bar)加压用于在加热前防止tfa/thf回流。在水解反应以后，反应混合物在进行蒸馏前降温至65℃以防止闪蒸失控。通过摄像机拍摄观测，确保所有的tfa/thf蒸发对于最终产物的ph值控制是非常重要的。
s260：继续向反应容器中加入氢氧化钾溶液(5n，0.5ml)并重新密封反应容器。将反应容器内的反应混合物继续加热至150℃，保持5min。然后将其冷却到65℃并加入乙酸溶液(10％,1.20ml)。
s270：将获得的粗产物上样到碳18半制备液相色谱柱中(经过5％乙醇溶解在0.9％盐溶液预处理)进行提纯。在6ml/min的色氨酸流速下，目标产物[11c]amt的保留时间为11-7min。
s280：经过液相色谱柱提纯后的产物被转移到0.22μm的过滤器中进行过滤，并转移到无菌瓶中(10ml)。具体的产品抽样检测标准及测试方法等可参见说明书和美国药典的具体说明。从采集[11c]co2获得开始计时，完整的合成过程耗时大约为42-45min。
虽然提纯的方法是快速并且简单的。但是，如何去除放射性的废水杂质等仍然存在问题。为了提高放射性物质的纯度，可以使用上述的高效液相色谱提纯方法。由于反应混合物中会存在黑色沉淀物，因此，在上样前需要使用0.22μm的过滤器。使用高效液相色谱的方法可以获得目标的化学放射性纯度(大于99％)。
如表格1所示，为应用本发明实施例方法，在三个反应容器中合成制备的目标产物的质量指标数据对比。
以下详细描述各个质量指标数据的测试方法和标准：
1、在petl-块后的目视检查要求中，目标产物[11c]amt必须是洁净、无色、无颗粒物。
2、通过sevenexcellenceph计(mettlertoledo，瑞士)测定目标产物的ph值。要求目标产物[11c]amt的ph值在4.5和8.5之间。
3、利用agilent1260高效液相色谱系统配备的柱温箱(安捷伦)、diodearraydetector(安捷伦；圣克拉拉、ca)和一个流动的ram放射性探测器(lablogic；谢菲尔德、英国)测定放射化学纯度。使用10％乙腈-缓冲液(0.7毫升/l磷酸和1.4ml/let3n)，在1.5毫升/分钟的流量下，使用xdb-c18柱测定目标产物的放射化学纯度和确认是否为目标产物。
4、目标产物的确认：通过计算相对保留时间rrt。rrt＝[11c]amt的保留时间/[12c]amt的保留时间。许可的标准为0.9-1.10。
以α甲基dl-色氨酸(sigma，m8377)作为非放射性碳-12的参考标准。在此条件下，α甲基dl-色氨酸的保留时间为4分钟18秒。
5、使用agilent1260高效液相色谱系统chiral-1nucleosil柱(4×250毫米)用10％乙腈缓冲液(ph4，1mm醋酸铜/1.7毫米醋酸)，流量1.5毫升/分钟进行手性纯度测定在上述条件下，对α-甲基化-d-色氨酸的保留时间为3分10秒；对α-甲基化-l-色氨酸的保留时间为4分钟11秒。
6、通过测量目标产物的半衰期并与放射性核素碳11进行比较来确定化合物(20.38分钟)。10分钟的衰减分析是由最终的放射性样品在biodexatomlabtm500剂量测量仪上完成。半衰期(t1/2)可以通过以下公式计算获得：t1/2＝-in2(时间差/in(结束时刻/开始时刻))。半衰期许可的标准为18.4–22.4min之间。
7、γ射线能量由多道分析器(ortec，digibase)分析。在超过2min的时段内，从1到1024kev对所有的放射性计数。峰值能量与c-11的能量谱一致。许可标准为511kev的峰值误差在正负10％之间。
8、放射性核素纯度也由多道分析仪(ortec，digibase)分析。在确定辐射的情况下，在超过4小时的时段内，从1到1024kev对所有的放射性计数，除了在511kev和1022kev以外。
9、在目标产物中，残留的thf含量用气相色谱分析(安捷伦6850)手动注射(注射量1μl和注射温度180℃)，火焰离子化检测器(检测器温度300℃)和一个硅胶手性柱(安捷伦、30米×0.53毫米1μm)进行检测。烘箱内温度范围为50℃到120℃。
在上述条件下，thf反应停留时间是1分36秒。据美国药典要求，thf的最大含量限制为720ppm。
10、使用30毫升的水冲洗无菌过滤器(针头仍附在一起)，然后通过调节器切换到氮气供应。针头浸入水中，氮气压力逐渐增加。压力上升超过过滤器接受压力(50磅)时，没有出现气泡流表明过滤器有效并符合标准。如果一个气泡流发生在50psi时，表明测试失败。
11、使用查尔斯河实验室
12、无菌实验也根据美国药典的指引进行。
在本实施例中，通过高效液相色谱法(3.4.3a)对目标产物的稳定性进行了分析。没有标记的降解产物可在两小时内被观测到。20.38分钟的半衰期要求目标产物在合成后大约2半小时(1小时)内注射。
关于反应容器的清洁工序是经过特定设计的，以满足由于气体和溶剂参与反应所导致的不同的清洁要求。在目标产物的合成和hplc纯化后，第一次清洗步骤是在单击控制面板上的“清洁”按钮后自动执行的。这个清洗的程序包括用氦气清洗gps合成器，用50％的乙醇(15毫升)和100％乙醇(35毫升)冲洗半成品塔。两个小时后，氩气进行冲洗目标产物废弃物管道从而去除在tfa容纳室中残余的tfa，并且浓缩在废弃管道内，可被冷凝槽(乙醇/丙酮)回收利用的thf/tfa液体。
放射性衰变完成后，通过运行另一种半自动清洗程序对系统进行第二次清洁。其使用清洗用水和乙醇清洁[11c]amt合成器，并吹入氩气干燥。考虑到干燥是生产成功的关键因素，编制了详细的手动清洗和干燥规程。所有与去质子化反应以及甲基化反应相关的管材和转换开关均从合成系统中拆卸并用水和乙醇洗涤，在80℃烘箱中烘干。
使用本发明实施例提供的合成制备方法，目标产物[11c]amt可以在较短时间内被合成，具有高收率和高纯度。上述公开的方法制备获得成品符合现行usp质量控制准则(如表格1所示)。
综上所述，上述使用高效液相色谱纯化的6步合成方法，在5.3±1.2％(n＝6，从[11c]co2计算)的非衰减校正的放射化学产率下，能够制备放射化学纯度高(>99％)，手性纯度高(l-[11c]amt>98％)和化学纯度(＞99％，)的产品。
在50分钟的时间内，可以从约55.5gbq(eob)的[11c]co2，通常在60-μa，15分钟回旋运行，大约15.4gbq的[11c]ch3i送到amt合成容器中，并且最终合成获得2.95±0.65gbq(n＝6，eos)可供使用的[11c]amt。整个自动化合成系统得到的可以很容易地通过任何宠物放射化学实验室采用，能够显著的提高[11c]amt的可用性。
本发明实施例还进一步提供了一种用于制备上述[11c]amt的模块化系统。该模块化系统以埃克特和齐格勒模块化实验系统(eckertandzieglermodularlabsystem)为基础，并进行相应的调整和设计以后，拼合连接各个模块从而满足合成制备amt的需要。
所述模块化系统包括两个主要部分：用于合成制备[11c]ch3i的模块化气相实验室系统(gasphasesystemgps)以及用于合成制备[11c]amt的模块化实验室系统。这两个实验室系统之间通过ptfe管道连通。当然，也可以通过其它合适的，具有化学抵抗力材料制成的管道或者连接件。
所述gps用于以[11c]co2为原料，制备获得[11c]ch3i的合成系统，包括10个模块。其根据指引安装和操作，并进行相应的修改。三个止回阀(接头套管，ss-2c1/3)被安装到相应的废气排出管道内(如图1所示的w1，w2以及w3)以阻止不需要的废气反向进入到反应容器中。所有的废气通过石棉网后，进入到铝衰减屏蔽箱内。
所述模块化实验室系统用于通过[11c]ch3i，制备获得[11c]amt。该反应合成[11c]amt的核心是帕尔贴反应模块(prm)，温度范围控制在40℃-150℃之间，由摄像机进行调整。
四个湿法反应在相同的5ml硅硼玻璃瓶(gracediscoverysciences；deerfield,il)中进行。提升机安装设置在反应器头部，用于控制气体流动和鼓泡的缝隙线。传输液体和气体的连接件为fep或者ptfe管道。使用受控制的氩气流令溶剂蒸发。经过冷阱(丙酮/干冰)和碱捕集器(氢氧化钠颗粒)后，放射性废气被送到衰变箱中，而液体的传输通过施加正压力的氩气来实现。一个svm模块，两个ssm模块(带止回阀的)以及一个ssm模块(带4通道流量控制阀)被装配到一起用于控制气体和液体的流动。
半制备型高效液相色谱纯化方法使用碳18柱(5μm,150×10.0mm,gracediscoveryscience；deerfield,il)。该柱装配在hplc模块中，与6/2道的电动加样泵、光学流体传感器以及5ml不锈钢进样环路以及多量程放射性探测器，配合色谱波长检测器k-200(λ＝254nm；knauergmbh,berlin,germany)以及两个高效液相色谱泵s100(knauergmbh,berlin,germany)。
整个合成制备系统放置在一个具有温度控制能力的容器内。其中，plc和两个高效液相色谱泵以及两个热量交换器分别被设置在容器的侧壁。所有的合成步骤都应用如图1所示的设计控制面板，在电脑上控制执行。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
技术特征：
1.一种11c-α-甲基-l-色氨酸的制备方法，其特征在于，包括：
将色氨酸前体与碳11标记的ch3i合成获得中间产物；
对所述中间产物加入tfa和氢氧化钾溶液进行水解反应，获得反应粗产物；
通过高效液相色谱，从所述反应粗产物中提纯获得所述11c-α-甲基-l-色氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ch3i通过如下方法制备获得：
制备碳11标记的co2；
以所述碳11标记的co2为原料，使用湿法制备法或者干法制备法制备获得所述ch3i。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在零下40摄氏度的环境下，所述色氨酸前体进行二异丙基氨基锂的去质子化反应以进行甲基化。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色氨酸前体为(2(s),3a,(r),8a(s)-(+)-六氢-8-(苯磺酰)吡咯[2,3-b]吲哚-1,2-二甲酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述中间产物为甲基化化合物，所述甲基化化合物如下的化学式所示：
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对所述中间产物加入tfa和氢氧化钾溶液进行水解反应，获得反应粗产物，具体包括：
加入所述tfa并加热到135℃中维持3min；
在冷却以后，通入惰性气流去除中间产物内的tfa和thf直至所述中间产物完全干燥；
向干燥后的中间产物加入氢氧化钾溶液，密封后加热到150℃，保持5min。
7.一种11c-α-甲基-l-色氨酸的制备系统，其特征在于，包括：
ch3i制备模块，用于合成制备碳11标记的ch3i；
11c-α-甲基-l-色氨酸制备模块，用于以色氨酸前体和所述碳11标记的ch3i为基础，制备所述11c-α-甲基-l-色氨酸；
所述ch3i制备模块与所述11c-α-甲基-l-色氨酸制备模块通过管道连接件连接。
8.根据权利要求7所述的制备系统，其特征在于，所述ch3i制备模块为模块化气相制备系统，用于以碳11标记的co2为原料，制备获得碳11标记的ch3i。
9.根据权利要求7所述的制备系统，其特征在于，所述11c-α-甲基-l-色氨酸制备模块包括：高效液相色谱模块，所述高效液相色谱模块用于纯化获得所述11c-α-甲基-l-色氨酸。
10.根据权利要求7所述的制备系统，其特征在于，所述系统中通入氩气流令溶剂蒸发，并通过施加具有预定压力的氩气驱动液体传输。
技术总结
本发明公开了一种11C‑α‑甲基‑L‑色氨酸的制备方法及其制备系统。所述制备方法包括：将色氨酸前体与碳11标记的CH3I合成获得中间产物；对所述中间产物加入TFA和氢氧化钾溶液进行水解反应，获得反应粗产物；通过高效液相色谱，从所述反应粗产物中提纯获得所述11C‑α‑甲基‑L‑色氨酸。以AMT前体和碳11标记的CH3I为原料，可以自动化并且可靠的生产制备11C‑α‑甲基‑L‑色氨酸供使用。整个方法制备获得的11C‑α‑甲基‑L‑色氨酸符合使用标准，系统的自动化程度高，有利于在科研和临床医疗研究中使用。
技术研发人员：田海滨
受保护的技术使用者：田海滨
技术研发日：.08.03
技术公布日：.02.14
