长读长宏基因组测序助力构建完整的微生物“生命之树”
Long-read metagenomics paves the way toward a complete microbial tree of life
Comment，1月12日，Nature Methods，[IF 47.99]
DOI：/10.1038/s41592-022-01726-6
原文链接：/articles/s41592-022-01726-6
第一作者：Mads Albertsen
通讯作者：Mads Albertsen
第一单位：奥尔堡大学
- 导读 -
长读长测序技术（Long-read sequencing）可以实现在微生物群落中个体基因组的重构、基因功能的预测，以及生物多样性的分析等，目前已在宏基因组学研究中得到广泛应用。1月12日，Nature Methods发表了丹麦奥尔堡大学Mads Albertsen题为“Long-read metagenomics paves the way toward a complete microbial tree of life”的评论文章，阐述了长读长宏基因组测序技术在构建完整的微生物“生命之树”中的重要作用。
- 正文 -
微生物群落对于生物圈中的大多数生命过程，以及应对当前和未来的环境挑战均至关重要。已有大量证据表明，微生物群落在全球变化、动植物疾病、新型抗生素发现，以及废弃物再利用等方面发挥着关键作用。在没有微生物的世界中，其他任何形式的生命也将不复存在，微生物的巨大应用潜力为改善人类造成的环境破坏提供了难得机遇。
随着测序技术的发展，基因组已成为许多研究的基本研究对象。在微生物基因组的研究历程中，通过实验室中获得的纯培养微生物是测序并分析微生物基因组的主要方法，为连接短读长测序无法测通的基因组重复序列（需要~7 kbp以测通核糖体RNA操纵子），完整闭环的微生物基因组培养后仍需复杂的实验过程以获得配对数据。目前，大多数标准的DNA提取方法均能够获得7 kbp的DNA片段，因此，Pacific Biosciences与Oxford Nanopore的三代测序技术已成为研究中获得完整闭环的微生物基因组的主要手段。然而，极端是例子是需要特殊的DNA提取方法，并采用Oxford Nanopore获得Mbp级别长读长也成为可能。
虽然通过模拟自然环境、缩小反应体积或新的细胞分选技术，使培养组学取得了巨大的进展，例如从Asgard古菌超门中获得的纯培养古菌，填补了对原核生物与真核生物之间进化认知的空白，然而要获得纯培养株系或特定微生物的富集仍需要较长时间。
首个从宏基因组中获得个体基因组的研究发表于，这一发现开启了以基因组为中心的宏基因组学相关研究。将宏基因组测序得到的混合了不同生物的序列组装得到物种个体的宏基因组组装基因组（MAGs，metagenome-assembled genomes）的过程称为“数据分箱（binning）”，这一过程旨在将每个已测序的DNA片段与来自同一生物体的其他DNA片段进行归类。数据分箱的方法最初仅关注四核苷酸频率（tetranucleotide frequencies）等序列组成的相关特征，的几项研究表明，短读长测序作为一种成本效益较高的测序技术，可通过对多个样本进行测序，并使用它们的覆盖率（coverage）实现单个细菌物种的基因组分离。结合了不同覆盖率的数据分箱和成本较低的短读长测序，宏基因组学的这一突破为基于新发现微生物基因组组装的大量相关研究提供了基础。
尽管在过去中，微生物基因组学领域通过短读长测序已取得了一定里程碑式的发现，但目前仍然未能获得对“生命之树”有代表性意义的微生物基因组。微生物物种的多样性突显了这一点，估计有数百万至数十亿种。这与在公共数据库中目前所有基因组代表性的 65,703 种原核生物物种形成鲜明对比 (GTDB v. 202)。
然而，长读长测序技术在过去几年已逐渐在测序质量和成本方面赶上短读长测序，这使得长读长测序成为了高通量和高质量MAGs组装的重要组成部分。目前，PacBio与Nanopore的最新一代测序平台已能够获得大量高质量的MAGs，并且在质量与成本方面均优于短读长测序技术。
MAGs的质量通常基于其完整性和污染程度进行评价，短读长测序的结果在多数情况下是高度碎片化的中等质量MAGs，基因组数据分箱后的完整度超过50%，且污染小于10%。虽然这些基因在聚类水平上具有较高价值，但它们缺失的基因增加了分类出现错误的可能性。此外，大多数中等质量的短读长测序结果均缺少16S rRNA基因，这一缺失限制了通过短读长测序获得的基因组与相关原位可视化技术的结合。通过长读长测序可获得完整度超过90%，污染小于5%，且包含全部rRNA基因的高质量MAGs，这使得对短读长测序缺失的基因与通路进行更可靠的分析，与原位分析技术结合，并挖掘依赖于高度连续的基因组组装的基因簇成为可能。
长读长测序显著提高了进行高质量MAGs组装的能力，但当微生物菌株多样性较高时获得高质量的基因组仍存在较大困难，且大多数MAGs没有与之相关的质粒时。然而，长读长测序结合Hi-C和DNA从头修饰检测等技术，将有望在基因组组装水平上实现株系水平的数据分箱与质粒关联。
在微生物学领域，人类肠道微生物组是一直以来的关注焦点，由美国国立卫生院(NIH)发起的“人类微生物组计划（Human Microbiome Project）”和由欧盟发起的“人类肠道宏基因组计划（Metagenomics of the Human Intestinal Tract）”仍在推进。而其他正在进行的针对于人类的大量大型项目，以及“地球生命DNA计划（the DNA of all life on Earth in 10 years）”居然并未将微生物群包括其中。
细菌和古菌基因组百科全书（GEBA，Genomic Encyclopedia of Bacteria and Archaea）中指出，通过单细胞基因组学与宏基因组学结合，对培养微生物及微生物“暗物质”进行测序，将有助于增加“生命之树”中微生物大分枝的覆盖度。以基因组为中心的长读长宏基因组测序使开启GEBA项目的新时代成为可能，解析地球上每个物种的基因组信息，为合理利用微生物资源提供了基础，同时对应对地球所面临的诸多挑战具有重要意义。
引用本文
Albertsen, M. Long-read metagenomics paves the way toward a complete microbial tree of life.Nat Methods20, 30–31 (). /10.1038/s41592-022-01726-6
- 作者简介 -
通讯作者
奥尔堡大学
微生物群落中心
Mads Albertsen
教授
团队官网：/
Google学术：/citations?user=cs4BKBIAAAAJ
研究方向：通过不同测序技术（包括宏基因组、宏转录组和扩增子测序等）探究复杂环境下的微生物群落生态学，致力于新应用、新方法及软件开发的相关技术。
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