TITLE：Salinity tolerance mechanisms of an Arctic Pelagophyte using comparative transcriptomic and gene expression analysis 译名：利用比较转录组和基因表达分析北极蓝藻耐盐机制 期刊：COMMUNICATIONS BIOLOGY 日期：5月 下载链接：/10.1038/s4-022-03461-2
研究介绍：
在转录水平上，关于微生物对短期盐度变化的适应的研究极少。北极微藻受海冰融化的影响暴露于盐度较低的环境，冰冻期形成盐水通道，盐度又较高。本篇文章研究了一个与冰相关的微藻在盐度从45到8之间的转录反应。结果表明，当培养菌暴露于逐渐降低的盐度时，差异基因表达的反应是括号。与盐度变化相关的关键基因涉及特定的代谢途径、转录因子和调控因子、蛋白激酶、碳水化合物活性酶和无机离子转运蛋白。盐度降低时，浮游植物的Na±H+转运蛋白和Na+ -Pi转运蛋白过表达，盐度升高时，K+通道复合物过表达。几种抗冻蛋白，一种冰结合蛋白和一种参与冷适应的酰基酯酶的不同表达，被观察到对寒冷盐水北极条件的特定适应。
研究目的：
确定浮游植物（CCMP2097）对盐度变化的范围和响应，以更深入地了解与冰相关的北极藻类的潜在遗传能力，以适应其受冰影响的栖息地可能遇到的实际盐度范围。
材料与方法： 材料：
使用了来自加拿大魁北克省拉瓦尔大学环境与计量科学实验室（LARSEM）的0.22μm过滤人工海水。使用EcoSense™ EC300A电导率仪（YSI Inc.）测量盐度，并通过稀释进行调整，以获得45，35，25，16至8的盐度目标范围。
方法： 序列数据处理
使用 BBDuk通过 kmer 匹配（kmer = 25）评估原始reads的伪像序列，允许1个不匹配，并从reads的3’端修剪检测到的伪影。 RNA spike-in读取、PhiX读取和包含任何N的读取被删除。使用Q6设置的phred修整方法执行质量修整。最后，修剪后（最小长度36 pb），长度阈值以下的读取被删除（最小长度25个碱基或原始读取长度的 1/3 - 以较长者为准）。使用 HISAT2 （v. 2.1.0） 将来自每个库的过滤读取与参考基因组对齐。使用 featureCounts74 计算的原始基因计数用于使用Pearson相关性评估生物复制之间的相关水平，并使用 DESeq2（v.1.18.1） 确定哪些复制将用于差异基因表达分析，以确定哪些基因在对条件。 Pvalue < 0.05 用于在条件之间调用基因DE。
使用定制方法处理序列数据。
使用FastQC（v.0.11.9）对来自 DOE JGI 的干净读数进行可视化，然后使用 Trimmomatic v.0.36（配对末端模式；最小长度 100 pb）进行修剪，这将导致不到100% 的基因定位。 CCMP2097 参考基因组是从JGI PhycoCosm 门户中检索到的。使用默认参数，使用 STAR （v.2.7.8a）将过滤的转录组读数映射到基因组上。所有进一步的分析均使用RStudio （v.1.4.1106）进行。进行了差异基因表达分析使用 R 中的 DESeq2 包。使用 DESeq2 包对所有转录组进行标准化，其中计数除以由基因计数的中位数比率确定的样本特定大小因子。功能注释是通过检索JGI Genome Portal上可用的注释来完成的。我们使用iTAK数据库（v1.6）和PlanTFDB数据库 （v5.0;http://planttfdb.cbi./）对上调和下调基因列表中的转录因子进行预测。我们使用 iTAK 数据库预测蛋白激酶，对于碳水化合物活性酶，我们使用了CAZY数据库。与其他研究一致，这两种识别 DEG 的方法发现了相似的结果。
时间和盐度变化的加权基因共表达网络分析（WGCNA）
为了进一步分析时间效应和培养物之间盐度的渐进变化，我们使用R中的WGCNA包进行了WCCNA。不同基因之间的邻接矩阵仅针对对照样品（n = 14）构建为18，所有样品的软阈值功率为16（n = 28）。所有重要的DEG都基于拓扑重叠矩阵（TOM）相似性进行分层聚类，并由动态混合树切割和具有注释颜色的模块执行，这些模块定义了树木切割的分支。少于50个基因的模块被合并到它们最近的较大邻居模块中。此外，利用Pearson相关性研究了模块之间的相关性以及盐度、采样时间和三重培养的变化，以找到与这些参数相关的关键模块。
统计和再现性
使用软件Past3（v.3.18）进行双向方差分析（ANOVA），以分析盐度变化与控制条件之间的时间效应，对营养物质浓度（每份一式两份，n = 6）、细胞活力（一式三份，n = 3）和生长速率（一式三份，n = 3）。主成分分析（PCA）和树状图分别使用R中的rda（）和hclust（）函数从素食和统计包中计算，以分离每种条件的转录组样本，并在三份之间分离。树状图是使用完全链接方法构建的，该方法可以找到相似的聚类。使用cca（）函数计算约束对应分析（CCA），根据采样时测得的养分消耗量和实际盐度值，区分每种盐度条件的不同转录组。为了表示相对于对数倍变化具有差异基因表达的上调和下调基因，我们通过散射（MA）图和使用DESeq2包计算的火山图进行了可视化。我们根据调整后的P值<0.05，对各盐度条件比较的上下调基因列表进行了过滤。
结果：
图1、将具有归一化reads的转录组样本进行聚类。实验盐度值用彩色圆圈表示，S.45对照为红色方块。每个方块中的数字代表采样时间（tc1到tc5）。具有所有样本的每个基因reads的Bray-Curtis相异性测量的CCA。箭头表示培养条件和每种盐度（S）的样品之间的显着相关性。b 每个基因的转录组reads转化为差异基因表达矩阵并使用主成分分析（PCA）进行聚类，c 使用R上stats包中的完整链接方法构建树状图。
图2、差异表达最多的top25基因。 基于R上DESeq2包中的vst（）函数的标准化和转换reads计数的聚类结果热图。大小因子（绿色）对应于每个转录组的测序深度。条件（采样时间下方的条）对应盐度处理，控制条件为S.45，上面的数字是采样时间。每个基因的注释在右边，用方块表示，每个类别都有一个单独的颜色。未知功能基因为黑色。带有信号肽的基因用实心圆圈表示，空心圆圈表示未发现信号肽。请注意，最低盐度（S.8）位于较高盐度和中等盐度之间。
图3、盐度逐渐变化的差异表达基因。 a 渐进式盐度变化的RNA-Seq分析的比较散点图。 每个点代表一个 unigene。|log2FC|＞2的点表示基因上调，|log2FC|＜2的点表示基因下调。 显示了每个数量的上调和下调基因。b 过滤后的上调和下调基因的散点图，调整后的P值 <0.05。c UpsetR图表示盐度条件比较之间的共享和独特基因。d KEGG和KOG通路的上调和下调基因的每个比较之间从较高盐度到较低盐度的变化。盐度处理由从红色的最高盐度 （S.45） 到绿松石的最低盐度 （S.8） 的颜色表示。
图4、最高盐度和最低盐度的差异表达基因（DEGs）。 黑色方块表示冰结合蛋白，黑色三角形表示参与冷冻/冷适应的蛋白质。a tc5-S.45（红点）和 t5-S.8（蓝点）的RNA-Seq分析的比较散点图。显示了过度调节的差异表达基因的每个数量（n）。b 显着DEG的散点图，调整后的P值<0.05。c, d 两个极端条件下前10个log2FC和最高log表达基因的reads，所有条件下的reads都显示在热图中。c 条形图表示按最高log2FC和最高log基因表达水平排序的tc5-S.45显着的前十个DEG。d 下图表示按最高log2FC和最高log基因表达水平排序的t5-S.8显着的前十个DEG。信号肽（P.）的存在用黑色圆圈表示。
图5、9个选定的PFAM基因家族或PROSITE类基因的差异表达。每次盐度比较的log2FC用蓝色和红色表示。盐度比较之间的过表达强度遵循惯例，红色表示在较高盐度下表达更多，蓝色表示在较低盐度下表达更多。第一列是S.45和S.8的比较。红色表示S.45过表达，蓝色表示S.8过表达。黑圈表示信号肽（p）的存在。TRs转录调节剂，TFs转录因子，PKs蛋白激酶，SM次生代谢物，CAZYmes碳水化合物活性酶。CAZYmes糖苷水解酶（GHs）。
图6、深海藻类耐受盐度波动的9种途径和潜在作用的比较。a 多个差异表达基因（DEGs）在每个采样时间（t1到t5）过度表达，导致盐度变化进行性下降，以及在tc5-S.45之间（控制）和t5-S.8在不同的类别中。b维恩图显示了上述所有类别中在高盐度（S.35和S.45组）、中盐度（S.16和S.25组）和低盐度（S.8组）之间共有和唯一的功能的数量。在（c）高盐和（d）低盐条件下，深海藻类的潜在生存策略。蓝色五边形代表冰结合蛋白（IBP）。TFs转录因子，TRs转录调节因子，PKs蛋白激酶，CAZYmes碳水化合物活性酶。
图7、本研究中DUF3494的冰结合蛋白。编码DUF3494的10个基因的柱状图和热图 （PF11999）。柱状图表示每个基因的基因表达水平（G.E.L.）。每次盐度比较的log2FC用蓝色和红色表示。b热图显示每种盐度条件下每个基因的平均（三次）reads数。右侧为采样时间后的对照（盐度45）。左侧为盐度（s）逐渐变化的结果。黑圈表示信号肽（p）的存在。c使用RAxML PROTGAMMAGTR从本研究所有转录组中发现的10个编码冰结合蛋白的基因的27个短序列和同一藻类的MMETSP转录组中的17个短序列比对（CCMP2097）生成最大似似值树。该树由613个氨基酸序列组成，引导支持次数为1000次。
结论：
我们在盐度从45到8的条件下培养分离物，并使用RNA-Seq转录组学来描述差异表达谱。基于对植物的研究，假设并发现转录因子和调节剂、蛋白激酶、碳水化合物活性酶、转运蛋白、次生代谢物和分泌物参与了浮游植物适应高盐度到低盐度的过程。具体来说，发现随着盐度的降低，Na+–H+反转运蛋白和Na+–Pi同向转运蛋白过度表达，但K±通道复合物在较高盐度下过度表达。研究者发现冰结合蛋白和抗冻蛋白在测试盐度条件下具有差异表达的潜在影响，表明低温适应和盐度之间存在紧密耦合。研究者推测这些关键基因赋予了适应盐度逐渐变化并促进在受海冰影响的海洋中生存的特性。
