HBV相关肝炎、肝硬化及肝癌患者DcR3的表达及其与Fas的关系 HBV相关肝炎、肝硬化及肝癌患者DcR3的表达及其与Fas的关系
梁冬雨，侯彦强，娄晓丽
（上海交通大学附属第一人民医院松江分院中心实验室，上海 00）
摘要：目的 研究乙型肝炎病毒（HBV）相关肝炎、肝硬化及肝癌患者诱骗受体3（DcR3）的表达情况及其与死亡受体Fas的关系。方法 常规检查34例慢性乙型肝炎患者、31例HBV相关肝硬化患者、28例HBV相关肝癌患者和28名健康体检者（正常对照组）的丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平及HBV DNA载量，其中10例行肝组织病理检查。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中DcR3的水平，并与ALT、HBV DNA载量作相关性分析。采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测肝组织中DcR3和Fas mRNA的水平，并作相关性分析。结果 慢性乙型肝炎组、HBV相关肝硬化组、HBV相关肝癌组与正常对照组比较，血清DcR3水平明显升高（P＜0.05），HBV相关肝癌组较其他组升高更明显（P＜0.05），其余各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。慢性乙型肝炎患者血清DcR3水平与ALT、HBV DNA呈正相关（r值分别为0.448 1、0.500 7，P＜0.05）。HBV相关肝癌患者癌组织中Fas mRNA表达降低（P＜0.05），且与DcR3 mRNA表达呈负相关（r=-0.794 1，P＜0.05）。结论 DcR3可能通过Fas参与HBV相关肝癌的发生和发展。
关键词：诱骗受体3；Fas受体；慢性乙型肝炎；肝硬化；肝癌
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是肝细胞肝癌发生的主要诱因。有临床研究发现，在中国50%以上的肝癌患者乙型肝炎表面抗原阳性[1]。诱骗受体3（decoy receptor 3，DcR3）是肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族的新成员，能够竞争性结合死亡配体FasL、LIGHT和TL1A，阻断相关信号转导通路，调节细胞增殖，抑制细胞凋亡[2]。有研究发现，肝癌组织中DcR3的表达远远大于其癌旁组织和正常组织，提示DcR3可能作为癌基因在肝癌的发生、发展中起重要作用[3]。本研究通过检测慢性乙型肝炎患者血清DcR3的水平并分析肝癌组织内DcR3与死亡受体Fas的相关性，进一步揭示DcR3和Fas在HBV相关肝癌发生、发展中的作用。
1 材料和方法
1.1 一般资料
选取在上海交通大学附属第一人民医院松江分院治疗的慢性乙型肝炎患者34例（男20例、女14例）、HBV相关肝硬化患者31例（男21例、女10例）、HBV相关肝癌患者28例（男20例、女8例），年龄27～80岁，所有病例均符合全国病毒性肝炎会议联合修订的《病毒性肝炎防治方案》中乙型病毒性肝炎的诊断标准。同时选取体检健康者28名作为正常对照组（男18名、女10名），年龄25～72岁，同时排除其他肝炎病毒感染及酒精、药物、免疫等其他原因引起的肝损伤。
1.2 方法
丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）测定采用罗氏公司7600全自动生化仪，HBV DNA定量检测采用罗氏聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）诊断系统，操作均严格按照仪器及试剂说明书进行。血清DcR3检测采用酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA），试剂盒购自上海研鑫生物科技有限公司，操作严格按照试剂盒说明书进行。肝组织内DcR3 mRNA和Fas mRNA检测采用荧光定量PCR。操作步骤：采用Trizol法一步裂解抽提肝组织内总RNA，然后用逆转录试剂盒将总RNA中的mRNA逆转录成cDNA，以逆转录好的cDNA为模板，利用SYBY试剂盒在ABI7500荧光PCR仪上进行实时定量PCR。结果以相对定量2-△△Ct表示。引物序列：DcR3 Reverse，AGCCACAAAGTCGATGACG；DcR3 Forward，AGGCTCTTCCTCCCATGAC。Fas Reverse，GGACCTTGAGTTGGACTTGC；Fas Forward，CAGCATCATCTTTGGAGAAGC。
1.3 统计学方法
应用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据以
表示，各组间比较采用方差分析，相关性分析采用Spearman方法，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组肝病患者和正常对照组血清DcR3水平的比较
ELISA结果显示，慢性乙型肝炎组、HBV相关肝硬化组、HBV相关肝癌组患者血清DcR3水平[（1.454±0.099）、（1.940±0.097）、（4.420±0.191）ng/mL]较正常对照组[（0.611± 0.066）ng/mL）明显升高（P＜0.05），HBV相关肝癌组较其他组升高更明显（P＜0.01）。其余各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。
图1 各组肝病患者和正常对照组血清DcR3的水平
注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与慢性乙型肝炎组比较，#P＜0.05；与HBV相关肝硬化组比较，△P＜0.05
2.2 慢性乙型肝炎患者血清DcR3水平与ALT、HBV DNA表达的相关性
利用Spearman方法进行相关性统计分析，结果显示，慢性乙型肝炎患者血清DcR3水平与ALT、HBV DNA呈正相关（r值分别为0.448 1、0.500 7，P＜0.05）。见图2。
图2 慢性乙型肝炎患者血清DcR3水平与ALT、HBV DNA表达的相关性
2.3 HBV相关肝癌患者肝组织中DcR3 mRNA及Fas mRNA的荧光定量PCR
选取10例HBV相关肝癌患者的肝组织进行病理检查，荧光定量PCR结果显示，肝癌组织中DcR3 mRNA的表达量（4.24±1.58）较正常组织（1.15±0.53）和癌旁组织（1.82±0.48）明显上升（P＜0.05），而肝癌组织中Fas mRNA的表达量（4.05±1.04）较癌旁组织（2.11±0.77）和正常组织（1.37±0.87）明显下降（P＜0.05）。见图3。
图3 HBV相关肝癌患者肝组织中DcR3 mRNA及Fas mRNA的表达水平
注：与正常组织DcR3 mRNA的表达量比较，*P＜0.05；与正常组织Fas mRNA的表达量比较，#P＜0.05；
DcR3；
Fas
2.4 肝癌组织中DcR3 mRNA与Fas mRNA的相关性
采用Spearman方法进行相关性统计分析，结果显示，肝癌组织中DcR3 mRNA的表达量与Fas mRNA存在负相关关系（r=-0.794 1，P＜0.05）。见图4。
图4 肝癌组织中DcR3 mRNA与Fas mRNA的相关性
3 讨论
DcR3是肿瘤坏死因子超家族成员之一，是一种分泌性蛋白。人类DcR3分子编码一条由300个氨基酸组成的多肽链，包括N端包含的肿瘤坏死因子超家族成员4个相对保守的半胱氨酸残基富集区（cysteine-rich domain，CRD），因此可以竞争性结合FasL、LIGHT和TL1A等死亡配体，阻断相关信号转导通路，调节细胞增殖，抑制细胞凋亡[4]。大量研究证实，DcR3在多种肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。在胰腺癌的研究中发现，DcR3能有力地阻断FasL诱导的人类胰腺癌细胞的凋亡[5]。对神经胶质细胞瘤患者及细胞系的体内、体外研究发现，肿瘤细胞高表达DcR3可有效地阻断LIGHT介导的细胞凋亡[6]。在对肝癌的研究中，CHEN等[3]发现肝癌组织中DcR3的表达远远大于癌旁组织和正常组织，提示DcR3可能作为癌基因在肝癌的发生、发展中起重要作用。HBV感染是肝癌发生的主要诱因，在中国，50%以上的肝癌患者乙型肝炎表面抗原阳性。HBV相关肝癌发病机制非常复杂，大量研究表明HBV及其编码蛋白对宿主基因尤其是肿瘤相关基因的调控在肝癌发生中发挥重要作用[7-8]。本研究发现，慢性乙型肝炎、HBV相关肝硬化及HBV相关肝癌患者血清DcR3的水平明显升高，且与疾病的轻重和病毒载量具有一定的相关性，提示DcR3可能作为癌基因参与HBV相关肝病的发生、发展。
细胞增殖和凋亡间的平衡失调在细胞发生癌变的过程中起重要作用[9]。参与细胞凋亡调控的蛋白很多，Fas/FasL途径是肝细胞凋亡的主要途径之一[10]。Fas亦属于肿瘤坏死因子受体家族成员，Fas蛋白作为细胞凋亡启动分子通过与其天然配体FasL结合而诱导细胞凋亡[11]。有研究发现，肝癌细胞对Fas诱导的凋亡具有抵抗作用，肝癌细胞能下调Fas受体的表达从而导致细胞凋亡减少[12]。本研究用实时定量PCR检测10例HBV相关肝癌患者肝癌组织、癌旁组织以及正常组织DcR3 mRNA及Fas mRNA的表达情况，结果发现，与正常组织和癌旁组织相比，肝癌组织中DcR3 mRNA的表达明显升高，而Fas mRNA的表达显著下降，这与以往报道基本一致。进一步对肝癌组织中DcR3 mRNA及Fas mRNA的表达进行相关性分析，结果发现二者呈一定的负相关。
综上所述，本研究发现慢性乙型肝炎、HBV相关肝硬化及HBV相关肝癌患者血清DcR3水平升高，且与疾病的进展及病毒载量呈一定的正相关；肝癌组织中DcR3 mRNA表达升高，Fas mRNA表达下降，并且二者呈一定的负相关。本研究结果提示，HBV感染与DcR3和Fas表达均有一定的关系，但DcR3和Fas在HBV致肝细胞癌变过程中的相互关系及作用尚待进一步研究。
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Relationship of DcR3 expression with Fas expression in patients with chronic hepatitis B，liver cirrhosis and liver cancer
LIANG Dongyu，HOU Yanqiang，LOU Xiaoli.
（Department of Central Laboratory，Songjiang Campus，Shanghai General Hospital，Shanghai Jiaotong University，Shanghai00，China）
Abstract：Objective To investigate the expression of serum decoy receptor 3 （DcR3） in patients with chronic hepatitis B，liver cirrhosis and liver cancer and its relationship with Fas expression. Methods Alanine aminotransferase （ALT）and hepatitis B virus（HBV） DNA load were determined in 34 patients with chronic hepatitis B，31 patients with liver cirrhosis，28 patients with liver cancer and 28 healthy subjects （healthy control group）. A total of 10 of the patients underwent liver tissue pathological examination. Serum DcR3 levels were determined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA），and the correlations of serum DcR3 levels with ALT and HBV DNA load were analyzed. The levels of serum DcR3 and Fas mRNA in liver tissue were determined by fluorescence quantitation polymerase chain reaction （PCR），and the correlation analysis was performed. Results Compared with healthy control group，serum DcR3 levels in 3 patient groups all increased （P＜0.05）. Serum DcR3 levels became higher in liver cancer group than the other 2 patient groups（P＜0.05）. There was no statistical significance between chronic hepatitis B and liver cirrhosis groups（P＞0.05）. Serum DcR3 levels were correlated with ALT and HBV DNA load（r=0.448 1 and 0.500 7，P＜0.05）. The expression of Fas mRNA decreased in liver tissue in liver cancer group（P＜0.05）. There was a negative correlation between the expressions of serum DcR3 and Fas mRNA（r=-0.794 1，P＜0.05）. Conclusions DcR3 affects the development of HBV-related liver cancer through Fas .
Key words：Decoy receptor 3；Fas receptor；Chronic hepatitis B；Liver cirrhosis；Liver cancer
文章编号：1673-8640（）03-0178-04
中图分类号：R446.62
文献标志码：A
DOI：10.3969/j.issn.1673-8640..03.005
（收稿日期：-06-23）
（本文编辑：姜 敏）
作者简介：国家自然科学基金青年科学基金项目（81401937）
作者简介：梁冬雨，女，1985年生，硕士，主管技师，主要从事感染与免疫研究。
通信作者：侯彦强，联系电话：021-67720300。
