Patterns of Immune Infiltration in HNC and Their ClinicalImplications:A Gene Expression-Based StudyHNC的免疫浸润模式及其临床意义:一项基于基因表达的研究方法步骤数据来源与数据处理从TCGA下载了HNC队列的RNA-seq数据(FPKM值),并使用Voom方法对其表达谱进行了标准化。初步筛选后,该研究共纳入了454例患者(11例正常和443例肿瘤,P<0.05),其中包括41例癌旁组织和11例配对的肿瘤组织。使用CIBERSOFT算法对TIICs(肿瘤细胞的免疫细胞)进行定量CIBERSOFT是一种基于基因的反卷积算法,它能推断出22种人类免疫细胞类型,并使用547个标记基因的特征来量化每种细胞类型的相对得分。为了增强结果的鲁棒性,CIBERSOFT算法基于Monte Carlo(蒙特卡洛)采样来获得每个样本的反卷积P值。总T细胞被视作CD8+T细胞、CD4+记忆激活T细胞等细胞比例的总和;总巨噬细胞的比例为M0、M1和M2巨噬细胞比例之和;总B细胞的比例被估计为初始和记忆B 细胞比例之和。
生存分析首先,作者使用R包“survival”在LM22免疫细胞亚群和OS之间进行了单变量Cox分析和Kaplan-Meier生存分析,筛选出22种可预测预后的人类免疫细胞表型。然后,使用多变量Cox回归分析进一步验证作为预后因素的22种免疫细胞表型。此外,这项研究还探讨了LM22免疫细胞与其他临床信息(如TNM分期,分级)之间的关联。
分子子类的识别为了进一步探索不同的TME细胞浸润模式,使用R包“CancerSubtypes”中的一致性聚类算法确定了簇数量。为了揭示簇间TME细胞浸润模型的潜在差异,使用未配对的t检验识别了差异表达基因(DEGs)和不同的免疫细胞类型(|log2 fold change|≥0.2,p<0.05)。
功能和通路富集分析为了揭示TME亚型中DEGs的潜在生物学意义,作者使用R包“ClusterProfiler”进行了GO和KEGG富集分析(FDR<0.05)。另外,从MSigDB数据库下载基因集(c2 curated signatures),进行了基因集变异分析(GSVA)。
结果展示TME在HNC中的分布及其亚型的临床病理特征通过CIBERSOFT算法系统地评估了TME细胞浸润模型和特征基因的图谱。图1展示了41个配对的肿瘤样本和11个配对的癌旁样本,显然,在HNC中TME细胞的比例在组内和组间存在显著差异。HNC癌旁组织总T细胞和总B细胞的比例高于肿瘤组织,总巨噬细胞主要分布于癌旁组织(图2)。此外,正常和肿瘤组之间,滤泡辅助T细胞,初始B细胞等发生显著改变,而记忆B细胞,浆细胞等没有明显改变(图3)。
图1
图2
图3从图4可以看出在HNC配对的癌旁样本中LM22免疫细胞之间呈现多个高度正关,而在肿瘤样本中,这种相关关系有所减少。因此可推断出TME细胞浸润程度的改变直接反映了两组之间的免疫差异。
图4就临床特征而言,在HNC HPV阳性组织中,CD8+T细胞,调节性T细胞等免疫细胞的比例高于HNC HPV阴性组织;在HNC HPV阴性样本中,M2型巨噬细胞、中性粒细胞等的比例更高(图5)。因此,这些结果表明异常的免疫浸润及其在HNC中的异质性这些调控过程可能在肿瘤的发展中起重要作用,也具有重要的临床意义。
图5识别预后的LM22免疫细胞亚型作者进行了单变量Cox回归来筛选所有肿瘤样本中的预后性LM22免疫细胞亚群,结果显示总共有6个免疫细胞亚群(嗜酸性粒细胞、调节性T细胞等)与OS显著相关(p<0.05,图6A)。然后,对上述免疫细胞亚群绘制了Kaplan-Meier曲线图并进行了对数秩检验,结果显示嗜酸性粒细胞、活化的肥大细胞、初始B细胞和滤泡辅助T细胞与HNC患者的OS密切相关(图7)。
图6A
图7接下来,多变量Cox比例风险回归分析进一步确定了预后的LM22免疫细胞亚群。结果表明,调节性T细胞(Tregs)与改善的预后相关(图6B)。使用ROC曲线评估LM22免疫细胞亚群的预后能力,其AUC如图8所示,相比于其他LM22免疫细胞亚群(AUC>0.05),滤泡辅助T细胞在HNC患者的风险预测中表现的效能最优。
图6B
图8随后,通过临床特征与LM22免疫细胞亚群之间的相关性来确定其相互关系。经分析,吸烟,TNM分期等临床协变量与LM22免疫细胞亚群没有显著相关性(图9)。在这些临床变量中,放射线,分级和HPV状态与免疫细胞亚群显著相关(图10)。
图9
图10分子HNC子类中的免疫细胞模式为了揭示TME在HNC中不同的免疫细胞群浸润情况,对所有肿瘤样本进行无监督一致性聚类来确定HNC的分子分类,通过K值来确定簇的最优数量。在评估了累积分布函数(CDF)曲线和一致性热图下面积的相对变化之后,作者选择了三个簇(K = 3)作为结果(图11)。此外,在图12中可以看出,簇与不同的生存模式相关。与簇I和簇III相比,簇II中的患者预后更好(P <0.001,对数秩检验)。
图11
图12每个HNC子组中基因/LM22免疫细胞组分的差异表达分析Kruskal-Wallis检验用于识别与每个簇显著相关的定量基因/LM22免疫细胞,这是根据LM22免疫细胞在三个簇中的比例决定的(图13)。然后,为了寻找HNC分子亚型与衍生亚型特异性生物标志物之间的分子差异,未配对的t检验用于识别与每种亚型显著相关的定量基因。3个簇之间的两两比较,每个簇都能检测到相应的差异表达mRNA(图14)。
图13
图14分子亚型的识别3个HNC簇的富集分析表明,最显著的GO terms包括细胞因子活性、免疫/炎症反应和趋化因子活性。此外,KEGG分析产生的所有通路均与免疫反应相关(图15)。使用R包“GSVA”对三个簇的基因集变异进行分析,从簇1到簇3所富集的通路数量逐渐增加。从图16可以观察到几个标志性的基因集,包括“TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB”和“APICAL_JUNCTION”等。
图15
图16